بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

العام لهذا البروتوكول هو تحسين التحقيقات في البيئة الغذائية ، خاصة من العينات الميدانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيئة شبكة الغذاء ، مثل تأثير الأنواع الغازية على التفاعلات الغذائية. الميزة الرئيسية هي التطبيق الإضافي لمزيد من الوقت لدمج التحليلات الغذائية لنفس العينات بالضبط وأنه يمكن تطبيقها من قبل كل عالم بيئة تقريبا.

على الرغم من أننا أنشأنا هذا النهج لتقديم نظرة ثاقبة لاستهلاك الفرائس للمستهلكين المائي ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا لأغراض أخرى ، على سبيل المثال ، لتحديد تكوين الأنواع داخل عينات اللافقاريات القاعية. سيوضح الإجراء كريستيان سودمان ، فني من مختبرنا. لبدء هذه التجربة ، قم بنقل الجهاز الهضمي المفترس الذي تم تشريحه مسبقا إلى أنبوب تفاعل آمن سعة ملليلتر يحتوي على 440 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الملح.

بتجميد العينات على الفور عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى استخراج الحمض النووي. بعد إزالة العينات من الفريزر ، ابدأ استخراج الحمض النووي باستخدام ملقط لإضافة حبة واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة خمسة ملليلتر إلى كل أنبوب عينة ، ثم اترك العينات على المقعد في درجة حرارة الغرفة لتذوب. باستخدام مطحنة الخرز ، قم بتجانس العينات لمدة دقيقة واحدة عند 15 هرتز.

بعد تدوير العينات بعد فترة وجيزة ، أضف 90 ميكرولترا من 10٪ SDS وخمسة ميكرولترات من 10 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز K إلى العينات. بعد ذلك ، قم بدوامة العينات جيدا ، واحتضانها عند 60 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 400 دورة في الدقيقة على ThermoMixer لمدة ساعة واحدة. لمزيد من تعزيز التحلل ، قم بتدوير العينات كل 10 دقائق خلال هذه الحضانة.

بعد دوران قصير بالطرد المركزي، أدخلت الماصة 350 ميكرولتر من خمسة كلوريد صوديوم مولار في العينات. دوامة لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة لخلط العينات تماما. ثم جهاز الطرد المركزي عند 16 ، 200 مرة جم عند خمس درجات مئوية لمدة 40 دقيقة.

لذا فإن أحد أهم الأشياء عند إخراج العينات من جهاز الطرد المركزي هو تجنب تحرك الخرزات وإزعاج الحبيبات التي تحتوي على جميع الجسيمات التي يجب إزالتها بالخطوة. بعد ذلك ، انقل بعناية ما يقرب من 600 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات. أضف 600 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المثلج ، واقلب الأنبوب بعناية عدة مرات.

يحفظ في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. بعد إخراج العينات من الفريزر ، قم بطردها عند 16 ، 200 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية مع التأكد من عدم فقد الحبيبات ، واستخدم مناديل ورقية لتجفيف الأنبوب بعناية.

اغسل هذه الكريات المحتوية على الحمض النووي عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول المثلج بنسبة 70٪ ثم الطرد المركزي عند 16 ، 200 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية بحذر ، واستخدم المناديل الورقية الخالية من النسالة لتجفيف الأنبوب بعناية. أخيرا ، باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر معدلة إلى ثمانية ميكرولترات ، قم بإزالة المادة الطاففية المتبقية بعناية ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات.

جفف الحبيبات حتى يتبخر كل الإيثانول. ثم أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، ودوامة لفترة وجيزة ، واتركها عند أربع درجات مئوية طوال الليل لإذابة الحبيبات. للتحقق من الكفاءة الوظيفية لعينات الحمض النووي المستخرجة هنا ، اختبر كل منها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام مجموعات أولية عالمية مناسبة لمصدر الغذاء المعني.

ابدأ بإضافة بادئات ، ومزيج dNTP ، ومخزن التفاعل ، وبوليميراز Taq DNA ، والماء النقي في أنبوب تفاعل 1.5 أو 2.5 مليلتر وتدوير خليط التفاعل القياسي. الآن ، لكل عينة من الحمض النووي ، انقل ميكرولتر واحد من مستخلص الحمض النووي المقابل إلى تسعة ميكرولترات من خليط التفاعل القياسي داخل لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أغلق اللوحة وضعها في جهاز التدوير الحراري وابدأ برنامج PCR.

بعد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي ، استخدم خيار المدى القصير لجهاز طرد مركزي صغير لتدوير منتجات PCR. ثم امزج ثلاثة ميكرولترات من كل منتج PCR مع ميكرولتر واحد من صبغة التحميل ست مرات. قم بتحميل هذه العينات في فتحات جل من جل الاغاروز المعد مسبقا.

قم بتحميل 1.5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي المكون من 100 زوج أساسي في فتحة واحدة من الجل كمعيار للحجم. أغلق غطاء وحدة الرحلان الكهربائي ، وقم بتوصيله بمصدر طاقة ، وقم بتشغيل الجل عند 100 فولت لكل سنتيمتر لمدة 35 دقيقة. بعد تشغيل الرحلان الكهربائي ، قم بإزالة الجل وضعه في حمام تلطيخ معد مسبقا لمدة 10 دقائق تقريبا.

أخيرا ، قم بإزالة الجل من حمام التلوين ، وضعه على نظام توثيق الجل ، وتصوره وفقا للدليل. لتحليل محتوى أمعاء المفترس ، استخدم حلول العمل المعدة مسبقا لمستخلص الحمض النووي. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنفصلة لكل مجموعة من مجموعات التمهيدي الخاصة بمجموعة الفرائس البالغ عددها 16 مجموعة.

قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي واحد مع الحمض النووي من عينة تنتمي إلى مجموعة الفرائس المعنية وتحكم سلبي واحد مع الحمض النووي من الأنواع المفترسة. من الأهمية بمكان توثيق تخصيص العينة داخل كل لوحة PCR بالضبط لتجنب تجميع عينات مختلفة أثناء تحميلها على لوحة تسلسل للكشف عن جهاز تسلسل التخصيص وتعيين النتائج الخاطئة في النهاية للفرد المستهلك. بعد ذلك ، قم بتشغيل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام نفس البروتوكول الموصوف سابقا ، مع تعديله وفقا لدرجة حرارة التلدين المحددة ورقم الدورة لكل مجموعة أولية مستخدمة.

للكشف عن الشظايا المضخمة في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه ، قم بإجراء تحليلات الأجزاء الآلية على دفعتين ، A و B. قم بإعداد خليط يحتوي على محلول تحميل العينة ، أو SLS ، ومعيار الحجم المعني لكل دفعة. بعد ذلك ، قم بإذابة منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المجمدة مسبقا لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الثمانية التي تنتمي إلى الدفعة المعنية ، مع التأكد من حفظها في الظلام. استخدم خيار المدى القصير لجهاز طرد مركزي صغير لتدويرها.

على لوحة التسلسل ، قم بتحميل عدد الآبار المقابلة لعدد العينات المراد تحليلها ب 22 ميكرولترا من الخليط القياسي بحجم SLS لكل عينة. ثم قم بتحميل ميكرولتر واحد من منتج PCR لكل تفاعل من تفاعلات PCR الثمانية في آبار اللوحة المعنية. بعد ذلك ، استخدم خيار المدى القصير لجهاز طرد مركزي صغير لتدوير هذا الخليط بعناية.

بعد ذلك ، قم بتغطية كل بئر بقطرة واحدة من الزيت المعدني. ثم املأ آبار التفاعل للوحة عازلة ب 250 إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل الحمض النووي. استخدم برنامج التسلسل الشعري لإنشاء إعداد عينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

تأكد من أن توزيع العينات داخل إعداد العينة يطابق توزيع العينة في لوحة التسلسل وأن إعداد العينة يحتوي على الطريقة المناسبة لمعالجة الدفعة المعنية. عند تحليل النتائج ، من المهم إعادة فحص التروجين الكهربائي لكل عينة بصريا وتأكيد / إلغاء تأكيد كل ذروة مستدعى لكل مجموعة برايمر علامة على حدة وإدراج قمم غير مسماة تتناسب مع معايير مجموعة العلامات التمهيدي يدويا أو حذف القمم الخاطئة. بعد إجراء تجارب التغذية لتحديد فعالية مجموعات التمهيدي الخاصة بالمجموعة التي تم إنشاؤها لتحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم إجراؤها في هذا البروتوكول ، تم تحليل نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي من الجهاز الهضمي المفترس باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بالإضافة إلى تعدد الأشكال أحادي الخيط ، أو SSCP.

كشف الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز عن نطاقات مفردة من الحمض النووي المزدوج الشريطة ، والتي لا يمكن تمييزها بين أنواع الفرائس المختلفة التي تمت دراستها. على النقيض من ذلك ، نجح الرحلان الكهربائي SSCP في التمييز بين أنواع الفرائس المختلفة من خلال مقارنة عينات محتوى الأمعاء بالعينات المرجعية. تم تسلسل الحمض النووي المستخرج من أمعاء سوس الماء بعد تجربة التغذية في فترات زمنية مختلفة بعد استهلاك الفريسة.

من ساعة إلى 50 ساعة بعد الرضاعة ، انخفضت الكميات النسبية من الحمض النووي للفريسة المكتشفة بشكل كبير. تم اختبار الحمض النووي المستخرج من البرمائيات الغازية ، Dikerogammarus villosus gut ، للحمض النووي للفريسة اللافقارية الكبيرة باستخدام 16 مجموعة تمهيدية خاصة بالمجموعة الموضحة في هذا البروتوكول. كان 16٪ فقط من محتويات أمعاء D.villosus إيجابية للحمض النووي الذي ينتمي إلى أي من أصناف الفرائس ال 16 المستهدفة.

علاوة على ذلك ، تم العثور على الحمض النووي ل 12 نوعا من الفرائس المختبرة في عينة واحدة على الأقل بينما لم يتم اكتشاف الحمض النووي لأربعة أصناف. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تطمئن إلى أن البادئات المستخدمة خاصة بالأصناف داخل نظامك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توسيع نطاق بحثك حول التفاعلات الغذائية من خلال استكمال الأساليب المستخدمة بشكل روتيني داخل مختبرك بالتحليلات الجينية.