ميكروديسيكشن التقاط المناظير باستخدام الأشعة الليزر الموجهة بأطلس الدماغ المناطق المتأثرة بالإصابات الرضية

الهدف العام من بروتوكول التشريح الدقيق لالتقاط الليزر هو جمع الخلايا من مناطق معينة من الدماغ المتأثرة بإصابات الدماغ الرضحية للتحليل الجزيئي. أنا الدكتورة هيلين هيلميش. سيوضح مساعد الخريجين ، هاريس وايز ، وهو طالب في برنامج الفيزيولوجيا المرضية البشرية والطب الانتقالي هنا في الفرع الطبي بجامعة تكساس كيف نستخدم طرق التشريح الدقيق لالتقاط الليزر في دراساتنا لإصابات الدماغ.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح آليات وعواقب التغيرات التي يسببها إصابات الدماغ الرضية في مناطق الدماغ المنفصلة ، مثل القشرة الأمامية ، التي تتحكم في الوظائف التنفيذية. والحصين وهو أمر مهم للعمليات المعتمدة على الذاكرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا دراسة تأثير عملية المرض على مناطق دماغية منفصلة متعددة أو أنواع خلايا فردية من نفس الدماغ.

قبل أي إجراء من إجراءات المضاعف المشترك الأصغر قبل ذلك يتضمن تحليل النسخ ، قم بتنظيف جميع الأسطح باستخدام المنظفات التي تزيل RNace للتخفيف من مخاطر التلوث وتدهور الحمض النووي الريبي. استرجع أنسجة المخ من التخزين. وتوضع في سيروستات مبرد إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر.

اسمح للدماغ بالتوازن مع درجة حرارة غرفة ناظم التبريد لمدة عشر دقائق تقريبا. ضع الدماغ ، الجانب البطني لأعلى ، على ورقة شاش أعلى مرحلة ناظم البرد. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة من الحمض النووي الريبي ، قم بقطع الجزء الخلفي فقط من المنقاري إلى المخيخ والجزء الأمامي للتصلب البصري.

ضع كمية صغيرة من وسط درجة حرارة القطع المثلى في قالبين منفصلين للتبريد. ضع الدماغ الذي يحتوي على قشرة الارتباط الأمامي ونواة المتكئة الأساسية في جانب واحد من قالب التبريد لأسفل. أضف وسيط OCT كاف لتغطية الأنسجة.

كرر هذه الخطوة مع قطعة من أنسجة المخ التي تحتوي على الحصين والنواة فوق التصادمية. اترك وسط OCT يتجمد تماما لمدة 20 دقيقة تقريبا في ناظم البرد. بمجرد تجميد الأنسجة ووسط OCT تماما ، اضغط على كمية صغيرة من OTC على رأس تثبيت.

اضغط على مادة ناجمة عن البرد مجمدة على رأس التثبيت واترك OCT يتجمد تماما بحيث يتم تثبيت القالب الذي يحتوي على الأنسجة بإحكام بالرأس. قم بتثبيت ملحق الرأس بحامل التقسيم وشد المسمار. اضبط زاوية القطع فيما يتعلق بشفرة التبريد باستخدام أذرع الضبط لضمان قطع الأقسام بالتساوي.

اضبط سمك القسم على 30 ميكرون. عند تقسيم كتلة الأنسجة التي تحتوي على الحصين و SEN ، قم بتقسيم حتى يتم تسطيح التصلب البصري عند بريجما 0.48 ملم عندما يصبح البطين الثالث واضحا. ثم اجمع أقساما ل SEM من هذه النقطة عن طريق وضع شرائح غشاء البولي إيثيلين نافثاليت بدرجة حرارة الغرفة برفق فوق الجزء العلوي من الأنسجة المقطعة.

تأكد بصريا من الالتزام بالشريحة من خلال التأكد من ذوبان الأنسجة و OTC تماما على الشريحة. قم بتخزين جميع الشرائح مع أقسام المناديل في ناظم البرد حتى تلطيخها. أوقف أقسام التجميع عند بريجما 0.72 ملم عندما يبدأ الانفصال فوق البصري.

لجمع الحصين ، قم بتقسيم حتى تظهر قرون التلفيف المسنن لطبقة الخلايا الحبيبية عند بريجما 3.00 ملم. اجمع الأقسام حتى يتم دمج الحقول الفرعية CA للحصين في الأقسام الإكليلية عند 4.78 ملم. هذا يسمح بجمع كامل الحصين تحت حج القحف وموقع الإصابة.

قبل التلوين ، اغسل جميع أطباق الأطباق ومنطقة التلوين في غطاء دخان كيميائي باستخدام منظف RNase الذي يزيل المزال. خذ رف الجوانب من ناظم البرد وضعه في غطاء الدخان. اترك الشرائح تسخن لمدة 30 ثانية.

تلطخ الأقسام باللون البنفسجي الكريسيل وشفافة بالمحلول الملحي. اترك رف الشرائح الملطخة يجف في الهواء لمدة لا تزيد عن عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان. بمجرد أن يجف ، انتقل على الفور إلى LCM.

قبل البدء في أي إجراء من إجراءات المضاعف المشترك الأصغر لتحليل الحمض النووي الريبي ، امسح منطقة التجميع والمنطقة المحيطة بالجهاز باستخدام RNAse الذي يزيل المنظف والإيثانول بنسبة 100٪. اقلب مفتاح الطاقة على وحدة توليد الليزر infared قبل تشغيل قاعدة المجهر واسمح للنظام بالتهيئة قبل بدء تشغيل البرنامج من سطح المكتب. بمجرد تمهيد البرنامج وتشغيله على الرغم من خطوات التهيئة ، افتح لوحة إعداد البرنامج واضغط على زر المرحلة الحالية.

ستنتقل المرحلة المعيارية إلى موضعها حيث يتم تحميل وتفريغ أغطية الماكرو LCM وتفريغها. ضع ما يصل إلى ثلاث شرائح غشاء قلم في الحوامل بحيث تكون الحافة المصقولة متجهة إلى اليمين. حدد منطقة معالجة الغطاء والشريحة الموجودة بجوار الشريحة المعنية وانقر فوق خانة الاختيار MEM لإعلام البرنامج بأنه تم تحميل شرائح زجاج الغشاء.

ثم انقر فوق الشريحة المطلوبة ليتم التقاطها أولا. لالتقاط صورة متجانبة لموقع الأنسجة واتجاه مواضع الغطاء، حدد صورة على شريط الأدوات وحدد اكتساب نظرة عامة. ضع المؤشر فوق المنطقة الموجودة على الصورة المتجانبة، وانقر بزر الماوس الأيمن، وحدد وضع حد أقصى في مركز المنطقة.

سيضع البرنامج تلقائيا حدا أقصى على الموضع المحدد. بعد تحديد موقع ليزر الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية ، اختر خيار الرسم اليدوي في جزء أدوات التحديد. باستخدام قلم شاشة تعمل باللمس ، ارسم حول محيط منطقة الاهتمام مع التأكد من عدم فقدان الاتصال بين شاشة اللمس ورأس القلم.

تأكد من توصيل نقطتي البداية والنهاية معا. لجمع الحصين ، يلتقط الليزر الحقول الفرعية للحصين CA1 و CA2 و CA3 بدءا من بريجما 3.00 ملم وباستخدام الطبقة الحبيبية المشكلة بالكامل من التلفيف المسنن كمعلم مادي لتحديد المورفولوجي. بعد التجميع ، انقل أغطية الماكرو LCM إلى موضع مراقبة الجودة وافحص الالتصاق الكامل للأنسجة من خلال التأكد بصريا من أن الأنسجة المقطوعة بالأشعة فوق البنفسجية متصلة بالغشاء.

من الضروري أن يقطع ليزر الأشعة فوق البنفسجية الأنسجة بأكملها. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى عدم اكتمال التصاق الأنسجة بغطاء المضاعف المشترك الأصغر (LCM). ثم ضع كل غطاء بسرعة في أنبوب تفاعل رقيق الجدران خال من RNAse سعة 0.5 مليلتر يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت ليزوس الخلية.

قم بتدوير العينات لفترة وجيزة لضمان الليزوس الكامل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لإجراء التحليل الجيني النهائي. فيما يلي صور تمثيلية لأقسام الأنسجة التي تم جمعها من الجانب الشبكي لموقع الإصابة مع وظائف ليزر الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية على نظام المضاعف المشترك الأصغر . هذه منطقة من قشرة الارتباط الجبهي.

تظهر هذه الصورة نفس المنطقة بعد التجميع. وهذا هو النسيج الموجود على الغطاء بعد التجميع. تظهر هذه الصورة مكونات الطبقات شبه اللحمية CA1 و CA2 و CA3 للحصين الواقعة بجوار القرون المكونة بالكامل للطبقة الحبيبية للتلفيف المسنن.

جمع مناطق CA2 و CA3 وشوهدت مجموعات الخلايا هذه على الغطاء. هنا ، تم استهداف منطقة من النواة المتكئة الأساسية القريبة من الطبقة الأمامية التي تم استهدافها بأمانة على الغطاء. أخيرا ، تم التقاط النواة المنقارية فوق التصاميم إلى chiasm فوق البصري بواسطة LCM بعد TBI.

بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لمعالجة دماغ واحد في ثماني ساعات تقريبا. يتضمن ذلك معالجة الأنسجة والتلوين و LCM. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التحليل اللاجيني للإجابة على الأسئلة المتعلقة بأنماط المثيلة أو التعبير الميكروني.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء المضاعف المشترك الأصغر في مناطق متعددة من الدماغ في نفس الدماغ.