نبات مروج التحليل: تحديد وتوصيف للعقيدات الجذرية المروج محددة في الفول المشتركة

تستخدم الجذور المشعرة للحصول على جذور محولة في Phaseolus باستخدام بنية مراسل. تستخدم الجذور المعدلة وراثيا الناتجة لفحص التعبير عن جين المراسل. تعد دراسات التعبير المروج ضرورية لفهم أنماط التعبير الزماني المكاني للجينات.

سنقوم اليوم بتوضيح منهجيات تحريض الجذور المشعرة ودراسة أنماط التعبير المحفز في الجذور المشعرة المعدلة وراثيا في ظل الظروف التكافلية للعقيدات الجذرية في Phaseolus. أنشأ Estrada-Navarrete وزملاؤه سابقا نظام الجذر المشعر الناجم عن Agrobacterium rhizogenes في Phaseolus. ستساعد الطريقة الحالية في تسريع مدة تحريض الجذور المشعرة وبالتالي تحسين تعدد استخدامات النظام.

عرض الإجراءات زميلي مانوج كومار أرثيكالا وطالبات البكالوريوس ألما ليتيسيا وبريندا ماريانا من مختبري. بادئ ذي بدء ، ابحث في تسلسل جين NIN في قاعدة بيانات الجينوم Phaseolus vulgaris من Phytozome ، وحدد الطول المطلوب للتسلسل في المنبع إلى ATG. تصميم قليل النوكليوتيدات بعد تحليل تسلسل المروج المناسب.

سيكون الحمض النووي الجيني Phaseolus المحضر حديثا بمثابة قالب لتضخيم تسلسل المروج PCR. قم بإعداد مزيج PCR الرئيسي مع بوليميراز Taq عالي الدقة ومكونات PCR القياسية ، جنبا إلى جنب مع قليل النوكليوتيدات المصممة مسبقا. Aliquot المزيج الرئيسي في أنابيب PCR 2 مل ، وقم بإجراء تضخيم جزء المحفز في جهاز تدوير حراري وببرنامج مناسب.

افصل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل كهربائيا على هلام الاغاروز بنسبة 1.2٪. تصور جزء NIN المضخم عند 700 زوج أساسي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم باستئصال الجزء واستنساخه في متجه إدخال البوابة pENTR / D-TOPO باتباع التعليمات القياسية.

قم بتحويل ميكرولترين من مزيج التفاعل إلى خلايا بكتريا قولونية مختصة عند 42 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، وقم بطلاء الإشريكية القولونية المحولة على LB مع 50 ملليغرام لكل لتر من الكاناميسين. قم بزراعة الخلايا المطلية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للبلازميدات المعزولة من مستعمرات الإشريكية القولونية المختارة عشوائيا باستخدام قليل النوكليوتيدات M13.

يجب أن يشير الجزء الموجود في 1024 زوجا أساسيا إلى استنساخ موجب. قم بإجراء تفاعل LR بين استنساخ الإدخال الموجب والمتجه الثنائي للوجهة. حول ميكرولترين من مزيج التفاعل إلى بكتريا قولونية ، وحدد المستعمرات على 100 ملليغرام لكل لتر من سبيكتينومايسين عند 37 درجة مئوية.

تضخيم البلازميدات باستخدام قليل النوكليوتيدات الخاصة ب NIN. يجب أن يتضخم الاستنساخ الإيجابي عند 700 زوج أساسي. تسلسل والتحقق من صحة جزء الاستنساخ.

تعبئة بناء محفز NIN في خلايا K599 Agrobacterium rhizogenes ذات الكفاءة الكهربائية. ومرة أخرى ، قم بتأكيد الاستنساخ باستخدام قليل النوكليوتيدات الخاصة بالمروج. يقوم الكبريت بتعقيم بذور Phaseolus vulgaris وينبت على أوراق ترشيح معقمة ورطبة لمدة يومين في الظلام عند 28 درجة مئوية.

انشر 150 ميكرولترا من خلايا Agrobacterium rhizogenes مع بناء NIN وناقل التحكم على ألواح LB مع اختيار سبيكتينومايسين. قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. قم بإزالة شتلات Phaseolus ، واكشط خلايا Agrobacterium rhizogenes بطرف منحني سعة 200 ميكرولتر من اللوحة.

وأعيدها في أنبوب Eppendorf بمل واحد من الماء المقطر المعقم. اجمع خلايا Agrobacterium rhizogenes في حقنة سعة ثلاثة مل ، وضع شتلات Phaseolus في إعداد الأنبوب المعد مسبقا. وخز القليل من hypocotyls البذور النابتة مع طرف الإبرة ، وفي نفس الوقت حقن خلايا Agrobacterium rhizogenes.

يجب الحرص على ألا تمر الإبرة عبر hypocotyl. حافظ على الشتلات المحقونة في غرفة نمو عند 28 درجة مئوية مع 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام. يجب أن يكون الكالس على hypocotyls المصابين مرئيا لمدة خمسة إلى سبعة أيام.

بعد أسبوعين ، قم بإزالة الجذر الأساسي عن طريق قطع الجذع بمقدار سنتيمترين أسفل الجذور المشعرة ، وزرعها في أواني تحتوي على الفيرميكوليت المعقم. في الوقت نفسه ، قم بتلقيح النباتات بمل واحد من Rhizobium tropici للحث على العقد. تأكد من تخفيف ثقافة Rhizobium إلى 6 عند OD 600.

حافظ على النباتات في غرفة نمو عند 28 درجة مئوية ، و 16 ساعة ضوء ، وثماني ساعات من الفترة الضوئية المظلمة ، والري بمحلول B و D. لدراسة أنماط التعبير الزماني المكاني لمدفع NIN ، يتم أخذ العينات في نقاط زمنية مختلفة. أخرج النباتات دون الإضرار بالجذور ، واغسل الجذور دون أي بقع من الفيرميكوليت.

اختر الجذور بشكل عشوائي من NIN ونباتات التحكم ، وانتقل إلى تلطيخ GUS الكيميائي النسيجي عن طريق احتضان العينات في مخزن فحص GUS عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في الظلام. راقب الجذور الملطخة ب GUS تحت المجهر الاستريو والمركب. توضح هذه الصورة تعبير محفز NIN الناجم عن Rhizobium في الجذور الأولية.

يمكن أيضا رؤية تعبير محفز NIN في خلايا الشعر الجذرية المصابة بالريزوبيوم. علاوة على ذلك ، يمكن توثيق تعبير GUS في مراحل مختلفة من تطور عقيدات الجذر. لم يشاهد تعبير GUS في جذور التحكم في النواقل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتصميم تركيبات المروج الخاصة بك ودراسة أنماط التعبير عن المروج في الجذور المشعرة المعدلة وراثيا من Phaseolus. يمكن توسيع هذا النظام لدراسة أنماط التعبير عن المحفز في ظل التفاعلات التكافلية ومسببات الأمراض الأخرى في Phaseolus وأيضا eudicots الأخرى.