إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي
ديسمبر 10, 2017
نقدم هنا لتكيف من الوضوح السلبي وأسلوب إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للتصور المفرج المبيض وجرابي الشعيرات الدموية في المبايض سليمة الماوس.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير رؤية كاملة ثلاثية الأبعاد لتوزيع الشعيرات الدموية في بصيلات مبيض الفأر وإظهار علاقاتها. المبيض هو عضو أساسي في التكاثر وفي الغدد الصماء. احسب كل مرحلة من مراحل النمو المختلفة للجريب والخلايا الجسدية.
بالإضافة إلى ذلك ، على عكس الأعضاء الأخرى ، لا يظهر المبيض التفرع المتكرر للوحدة الوظيفية. قد يكون نظام الأوعية الدموية المحلي جنبا إلى جنب مع الجهاز العصبي قادرا أيضا على الخضوع لتغييرات كبيرة في كل دورة شهرية لدى الإناث البالغات. يتيح لنا تطبيق الوضوح السلبي في المبيض رؤية التوزيع الكلي والاتصال بين تلك الخلايا والبصيلات في المبيض.
معظم مفتاح هذا الإجراء هو أنه له أقل تأثير على المبيض ، ويفسر إزالة العلامات المختلفة. من خلال إعادة بناء الصورة المجهرية قدمنا خريطة للمبيض. يمكن ملاحظة بعض تفاصيل الأوعية والخلايا العصبية والبصيلات بوضوح.
لتحليل الصور ، تم استخدام بعض خيارات Imaris لتقييم العلاقات بين المبيض والهياكل. قم بإعداد محاليل وفيرة وفقا لتعليمات المقالة واحتفظ بها على الجليد. قم بتخدير الفئران وتأكد من عدم استجابة الماوس لقرص إصبع القدم.
رش الإيثانول ، وقم بعمل شق في الأذين الأيمن ، ثم قم بغزارة البطين الأيسر على الفور ب 20 مل من PBS المثلج بسرعة 10 مل في الدقيقة لطرد الدم. ثم غزير بمحلول هيدروجيل بارد بنفس السرعة. اجمع المبايض وكذلك الرحم للحفاظ على سلامة مورفولوجيا المبيض.
انقل المبايض المنفصلة إلى محلول الهيدروجيل البارد. تحت المجهر الاستريو إزالة الأنسجة الدهنية حول المبيض. للحصول على نتيجة أفضل لتثبيت الأنسجة ، نوصي بإزالة الجراب المبيضي.
احتفظ بالمبايض في محلول هيدروجيل لمدة ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أيام ، انقل المبايض إلى أنبوب زجاجي واملأ الأنبوب بمحلول هيدروجيل جديد. قم بتمديد البارافيلم فوق الجزء العلوي من الأنبوب ثم لف بارافيلم آخر حول عنق الأنبوب.
تأكد من عدم وجود فقاعات بين البارافيلم ومحلول الهيدروجيل. ضع الأنبوب الزجاجي على حاضنة شاكر على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين حتى يتشكل الهلام. قم بإزالة الجل الزائد حول المبايض بعناية باستخدام مرشح ورقي.
ضع المبايض في أنبوب سعة 15 مل واملأ الأنبوب ب 10 مل من محلول المقاصة. ضع الأنبوب على حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة شهرين على الأقل. قم بتغيير محلول المقاصة كل يوم في الأيام الثلاثة الأولى ثم أسبوعيا حتى يتم تنظيف المبيض.
تتم جميع إجراءات التلوين المناعي عند 37 درجة مئوية على شاكر. أولا ، اغسل المبيض في PBST لمدة 24 ساعة. احتضان المبيض الثاني في الجسم المضاد الأولي المخفف بواسطة PBST لمدة يومين.
ثالثا ، اغسل الأجسام المضادة الأولية باستخدام المخزن المؤقت PBST. رابعا ، احتضان المبيض بالجسم المضاد الثانوي المطلوب في PBST لمدة يومين. خامسا ، اغسل الأجسام المضادة الثانوية باستخدام PBST.
سادسا ، انقل المبيض إلى محلول مطابقة معامل الانكسار لتجانس RI. تحقق من الشفافية البصرية ، عندما يتم توضيح المبيض بالكامل ، يمكن تصويره. أولا ، قم بإعداد طبق زجاجي نظيف.
اصنع أسطوانة معجون وشكلها على شكل حدوة حصان. اضغط على الحافة الخارجية بإحكام على شريحة زجاجية لعمل مساحة مغلقة. يجب أن يكون ارتفاع المعجون أعلى قليلا من المبيض.
انقل المبيض بعناية إلى المركز وأضف محلول التثبيت. ادفع طبقا فوق المعجون واستخدم قطعتين من المعجون لإصلاحه. عندما يكون المبيض جاهزا للتصوير ، يمكن تحديد مجهر نيكون متحد البؤر بعدسة 16X لتصويره.
للتصوير باستخدام المجهر متحد البؤر، اختر أولا العدسة في لوحة Ni-E. في اكتساب اللوحة، حدد عدد القنوات. أولا ، استخدم علامة تبويب منفذ العين وعصا التحكم وحدة التحكم XY لنقل الأنسجة إلى مركز المجال من خلال الفحص بواسطة العدسات المجهرية.
ثانيا ، بعد إطفاء ضوء الغالق ، انقر فوق علامة التبويب live لضبط طاقة الليزر و HV والإزاحة لكل قناة. في لوحة Z Intensity Correction اضبط الاستحواذ للطبقة العليا ، انقر فوق زر علامة الجمع لتحديد الجزء العلوي ، وحرك العدسة لأسفل ، وقم بتعيين HV المناسب وطاقة الليزر إلى أسفل الأنسجة وأضف معلومات الطبقة السفلية ، انقر فوق إلى ND لمزامنة الإعداد مع اللوحة والاستحواذ. وفي الاستحواذ ، قم أولا بتعيين عدد خطوات المسح.
انقر فوق علامات تبويب Z والصورة الكبيرة. ثانيا ، انتقل إلى نافذة المسح الضوئي للصورة الكبيرة لتحديد حجم المجال وفقا لحدود الأنسجة. ثالثا ، ارجع إلى اكتساب ND لإدخال حجم حقول المسح واختيار التداخل في حدود 10 و 50٪ ثم انقر فوق تشغيل تصحيح Z وانتظر عملية التصوير.
استخدم أولا imagic لفتح ملف NIS الأصلي. انقر فوق زر الصورة ، واختر قنوات اللون والعرض ، ثم انقر فوق ملف ، واختر تسلسلات الصور واحفظها بشكل منفصل كملفات tiff. ثانيا ، استخدم Imaris لفتح أحد ملفات tiff.
انقر فوق الزر "تحرير" واختر إضافة قنوات لإضافة الباقي. يمكن تغيير الاسم واللون في ضبط الشاشة. يجب أيضا تصحيح سمك الأنسجة في خصائص الصورة.
ثالثا ، انقر فوق الزر "تحرير" واختر Crop 3D لقص الجزء الإضافي. أولا ، انقر فوق الزر "خيوط" وانقر فوق التالي. انتقل إلى لوحة الشريحة ، وابحث عن وعاء التتبع والمسافة ، ثم عد إلى التجاوز ، وأدخل الثابت وانقر فوق التالي.
ثانيا ، اضبط عتبة نقطة البداية وتعيينها. في لوحة الكاميرا ، اختر التحديد ، واضغط على shift وانقر على النقطة لإزالة الجزء الإضافي. ثالثا ، اختر أعلى حد وانقر فوق التالي.
لا تحدد اكتشاف النقاط وانتقل إلى التالي. يمكن إزالة بعض الأجزاء الزائدة في لوحة التحرير. يمكن تحرير اللون بالنقر فوق اللون.
تم التحقيق في بنية الأوعية الدموية المبيضية ثلاثية الأبعاد بعد تلطيخ المناعة CD31. يمكن ملاحظة الهيكل ثلاثي الأبعاد إما عن طريق الشرائح من خلال شرائح أخرى أو بالكامل من خلال عرض الحجم. CD 31 هو تلطيخ الأوعية الدموية الجرابية للفأر البالغ تم إجراؤه.
من خلال إعادة بناء الشعيرات الدموية بواسطة الخيوط ، يمكننا إظهار العلاقة بين البصيلات الفردية والشعيرات الدموية. المبيض ، مثل المرأة ، دائما ما يكون نشطا وقابلا للتبديل. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية التحليل النسيجي التقليدي ، من الصعب جدا وصف العلاقات بين هذه المكونات المعقدة.
الطريقة المطورة حديثا ، قد يساعدنا الوضوح السلبي في التغلب على العقبة البصرية ، والحفاظ على سلامة الأنسجة بأكملها ، وتوفير القرائن الوظيفية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تكيفًا لطريقة CLARITY السلبية لتصور الأوعية الدموية المبيضية والشعيرات الدموية الجرابية في المبايض السليمة للفئران. يهدف البروتوكول إلى توفير رؤية ثلاثية الأبعاد شاملة لتوزيع الشعيرات الدموية داخل الجريبات المبيضية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التناسلي
- علم الأحياء الوعائي
الخلفية
- يلعب المبيض دورًا حيويًا في التكاثر والغدد الصماء.
- تخضع الجريبات لمراحل تطور مختلفة، ولكل منها خلايا جسدية مميزة.
- على عكس الأعضاء الأخرى، لا يعرض المبيض تفريعًا متكررًا للوحدات الوظيفية.
- يمكن أن يتغير النظام الوعائي في المبيض بشكل كبير خلال كل دورة شهرية.
هدف الدراسة
- لتصور التوزيع العام للشعيرات الدموية في جريب المبيض للفأر.
- لتوضيح العلاقات بين الخلايا والجريبات داخل المبيض.
- لتعزيز فهم وعائية المبيض وآثارها على الصحة الإنجابية.
الطرق المستخدمة
- تطبيق تقنية CLARITY السلبية.
- إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية المبيضية.
- تصور الشعيرات الدموية الجرابية في المبايض السليمة للفئران.
- عد مراحل التطور المختلفة للجريبات والخلايا الجسدية.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لشبكات الشعيرات الدموية في جريب المبيض.
- رسم خرائط مفصل للوصلات الوعائية بين الجريبات.
- أفكار حول التغيرات الديناميكية في الأوعية الدموية المبيضية.
- تأسيس إطار عمل للدراسات المستقبلية حول بيولوجيا المبيض.
الخلاصات
- تكشف طريقة CLARITY السلبية بشكل فعال عن بنية الأوعية الدموية للمبيض.
- يمكن أن يتقدم هذا النهج فهمنا لوظيفة المبيض وصحته.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لاستكشاف الغدد الصماء الإنجابية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Visualizing intact ovarian vasculature in 3D enables mechanistic de-risking of reproductive target hypotheses by clarifying structural relationships between follicles and their capillary networks. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of vascular architecture that can inform target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: linking anatomical context to functional ovarian biology without tissue distortion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping follicular capillary length to follicular wall volume, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides a standardized, shrinkage-minimized clearing protocol that preserves tissue integrity for reproducible vascular analysis.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through quantitative correlation data (P<0.01) between capillary extent and follicular development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated 3D vascular maps that serve as disease-relevant systems for assessing compound effects on ovarian microstructure.
- Operational Value: Enables assay standardization via consistent immunostaining (CD31), clearing, and imaging parameters across follicles.
- Scalability: Supports platform reuse through adaptable clearing and reconstruction workflows applicable to other endocrine tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-stage vascular phenotypes to preclinical models by preserving native ovarian architecture for longitudinal study.
- Mechanistic De-risking: Clarifies neurovascular interactions in the ovary, reducing ambiguity in endocrine target pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides structural biomarkers (e.g., capillary length, follicular volume) to inform go/no-go decisions in follicle-modulating programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of vascular contributions to follicle maturation, supporting lead identification through phenotypic vascular profiling, and informing preclinical validation via intact tissue phenotyping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of vascular regulators in follicle development through direct 3D visualization of capillary networks.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared ovarian tissue with quantitative vascular outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric measurements (capillary length, follicular volume) and correlation statistics to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains histological fidelity from discovery through preclinical stages by avoiding tissue sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular mapping capability for endocrine and reproductive tissue atlases across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in ovarian vascular biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via passive CLARITY’s minimal tissue perturbation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular-related follicle phenotypes, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on vascular-structural phenotypes in follicle cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel-based tissue clearing, immunostaining, and multiphoton confocal microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including shaker incubators, refractive index matching systems, and 3D reconstruction software (e.g., Imaris).
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration, antibody validation, and imaging parameters for reproducible vascular quantification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-ovarian tissues due to differences in density and lipid content.
- Limited by extended clearing timelines (up to two months) and the need for optimized antibody penetration in dense stromal regions.
