توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

الهدف العام من هذه التجربة هو وصف كيفية تصنيع العاثيات من جينومها باستخدام نظام ترجمة نسخ خال من الخلايا الإشريكية القولونية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التركيبية ، مثل توضيح آليات التجميع الذاتي الجزيئي في الأنظمة الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تعدد استخدامات النظام الأساسي.

يمكن تلخيص العديد من الأنظمة البيولوجية بالكامل وضبطها بدقة للتحليل التجريبي. ابدأ هذا الإجراء بإعداد لويحات العاثيات كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم طرف ماصة باستور المعقمة لقلب وإزالة لوحة واحدة.

انفخ البلاك في الخلايا المخففة. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. لاختبار العدوى الكاملة ، خذ عينة سعة 500 ميكرولتر في أنبوب سعة 1.5 مليلتر وأضف 10 ميكرولتر من الكلوروفورم.

بدوامة الخليط على الفور بسرعة عالية ولاحظ ما إذا كان المحلول يوضح ، مما يشير إلى إصابة العاثية. بمجرد إصابة الخلايا بالكامل ، احتضنها لمدة ساعتين أخريين. بعد ذلك ، أضف DNase قبل الطرد المركزي للخلايا عند 8،000 مرة جم وأربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من كلوريد المغنيسيوم 1X Tris. أضف 500 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة بسرعة عالية لتحلل الخلايا. قم بالتوضيح عن طريق الطرد المركزي عند 12 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بإخراج المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وتخزينها عند أربع درجات مئوية. قم بإعداد أربعة تدرجات من خمسة إلى 45٪ من السكروز عن طريق سحب 2.5 مل من 45٪ من السكروز في أربعة أنابيب للطرد المركزي الفائق. ضع فوق الطبقة ما يقرب من 2.6 مل من السكروز بنسبة 5٪ ، وتتوقف عندما يصل السائل إلى ملليمترين من حافة الأنبوب.

امزج التدرجات عن طريق دوران أنبوب الإمالة باستخدام أداة تشكيل التدرج لمدة 43 ثانية عند 86 درجة و 23 دورة في الدقيقة. باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد، أضف 500 ميكرولتر من معلق العاثية المجمعة عن طريق ملامسة الطرف لسطح السائل وتوزيع الحجم ببطء شديد على الجزء العلوي من تدرج السكروز، مع الحرص على عدم الاختلاط من خلال سحب العينات السريع. جهاز طرد مركزي عند 70،000 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

اغمر القنية الحادة في المحلول حتى يتمركز الطرف على الحافة العلوية لشريط العاثية. قم بإزالة الشريط عن طريق الرسم على مكبس المحقنة حتى تتم إزالة غالبية شريط العاثية. ثم أضف حجم السكروز مع العاثية المعلقة إلى ثلاثة أو أربعة أنابيب طرد مركزي فائقة.

املأ الأنابيب بما يتراوح بين ثلاثة وأربعة ملليمترات من أعلى الأنبوب باستخدام 1XTM البارد. غطي الأنابيب بغشاء البارافين واقلبيها للخلط. ضع الأنابيب مرة أخرى في جهاز طرد مركزي فائق وقضيه عند 145،000 مرة غرام لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

اسكب المادة الطافية بسرعة وصفيها رأسا على عقب على مناديل مبللة يمكن التخلص منها. قسم 200 إلى 400 ميكرولتر من 1XTM البارد على جميع الكريات وأعد تعليقها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. لا يلزم الاهتزاز.

في اليوم السابق لعمل العيارات ، قم بإعداد مزرعة الخلايا المضيفة للإشريكية القولونية في 10 ملليلتر من وسائط نمو LB واترك المزرعة في حاضنة اهتزازية مضبوطة على 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق سحب 5.25 مل من الأجار العلوي ، و 220 ميكرولترا من عينات العاثيات المخففة ، و 50 ميكرولترا من الخلايا البكتيرية المضيفة إلى أنبوب استزراع سعة 14 ملليلترا. قم بتغطية أنبوب الثقافة والدوامة بسرعة عالية.

استرجع لوحين للاستزراع من حاضنة 37 درجة مئوية. ثم أضف 2.5 مل من المزيج الرئيسي ببطء إلى وسط اللوحة الأولى. قم بتدوير اللوحة برفق يدويا لتوزيع المزيج الرئيسي بالتساوي بحيث يمتد على لوحة الثقافة بأكملها.

انتظر 20 دقيقة لضمان تصلب الأجار العلوي. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى سبع ساعات. عد اللويحات وحدد تركيز العاثيات لكل عينة تفاعل.

خفف جزءا من مخزون العاثيات إلى 400 ميكرولتر باستخدام عازلة 1XTM في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف حجما متساويا من كلوروفورم الفينول Tris إلى التخفيف. رج الخليط برفق على هزاز المختبر أو باليد لمدة خمس دقائق.

ثم قم بالطرد المركزي للمستحلب الناتج عند 17 ، 000 مرة جم في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة خمس إلى 10 دقائق. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد ، مع الحرص على عدم إزعاج حدود الطور البيني. كرر هذه الخطوات مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاثة عمليات استخراج للفينول.

انقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد وأضف حجما متساويا من الكلوروفورم. رج العبوة والطرد المركزي قبل نقل عينة الحمض النووي المائي إلى أنبوب نظيف. بعد ذلك ، أضف 0.4 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية وثلاثة أحجام من 95٪ من الإيثانول.

ضع الأنبوب في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لهطول الأمطار طوال الليل. جهاز طرد مركزي عند 17 ، 000 مرة في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها ، إما عن طريق الصب أو سحب العينات.

ثم أضف 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول وقم بهز الأنبوب برفق حتى تطفو الحبيبات خالية من قاع الأنبوب. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الإيثانول والتخلص منه ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. بعد إضافة الإيثانول والطرد المركزي كما كان من قبل ، قم بإزالة الإيثانول والتخلص منه مرة ثانية ، مع الحرص مرة أخرى على عدم إزعاج الحبيبات.

جفف الحبيبات بالهواء على سطح الطاولة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بمجرد أن يجف ، أضف 50 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج إلى الحبيبات واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية لإعادة التعليق. حدد تركيز الحمض النووي باستخدام قياسات الامتصاص عند 280 نانومتر.

لإجراء التفاعل الخالي من الخلايا ، قم بتقسيم الحجم المشار إليه من المستخلص الخام ، 33٪ من حجم التفاعل النهائي ، في أنبوب طرد مركزي دقيق. قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو مدرج في بروتوكول النص. أضف الحجم المناسب لكل مكون إلى المستخلص الخام.

بعد إضافة المكون الأخير ، قم بتجانس التفاعل عن طريق الدوامة. ثم تقسيم المزيج الرئيسي إلى n أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. بعد ذلك ، أضف وحدات التخزين المشار إليها للمكونات المتغيرة إلى مصفوفة المزيج الرئيسية.

أضف الماء إلى كل تفاعل للوصول إلى حجم التفاعل النهائي المطلوب قبل الدوامة. ثم احتضان أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 29 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات على الأقل أو طوال الليل. بعد تحضير الخلايا لعيار العاثية كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بمعايرة محلول LB النهائي الخالي من الخلايا كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو.

تظهر هنا نتائج تمثيلية لتفاعل خال من الخلايا لتوليف phi X 174 عاثية. تظهر لوحة العاثية هذه تفاعلا ناجحا للعاثيات تم تعديله عند التخفيف المناسب ، ويتضح من العدد القابل للعد من اللويحات. ومع ذلك ، يمكن أن يظهر التفاعل الناجح بشكل سيئ إذا كان عامل التخفيف منخفضا جدا بالنسبة لعائد العاثية للتفاعل.

تظهر هذه اللوحة عددا لا يحصى من اللوحات. تظهر هنا لوحة ذات توزيع غير متجانس لويحات العاثيات بسبب عدم كفاية التوازن المسبق لدرجة حرارة لوحة الثقافة. أثناء عيار العاثية ، عززت لوحة الثقافة التفاعل في الجزء الأيمن السفلي من اللوحة.

ظروف الازدحام الجزيئي لها تأثير قوي على تخليق العاثيات ل phi X 174 وعلى وجه T7.In الخصوص ، ينخفض إنتاج العاثيات ل T7 بثلاثة أوامر من حيث الحجم عندما تنخفض تركيزات PEG من أربعة إلى 2٪ من الوزن من حيث الحجم. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تنقية العاثيات واستخراج الحمض النووي في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يستغرق التفاعل الخالي من الخلايا ساعات فقط عندما لا تكون هناك مشاكل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة العاثيات ، واستخراج وتنقية الحمض النووي ، واستخدام النتيجة لإعادة تكوين العاثيات المعدية بالكامل باستخدام نظام التفاعل الخالي من الخلايا. يمكن أن يكون العمل مع الفينول خطيرا للغاية ، ويجب ارتداء الاحتياطات مثل معطف المختبر وحماية العين والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء. يجب تنفيذ جميع الأعمال مع حاويات مفتوحة من الفينول في غطاء الدخان.