التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

الهدف العام من هذا البروتوكول هو اشتقاق خلايا جذعية متجانسة متعددة القدرات يسببها الإنسان. يمكن استخدام هذه الطريقة لاشتقاق الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان لأغراض عديدة بما في ذلك نمذجة الأمراض أو فحص الأدوية أو اشتقاق الخلايا لتجارب العلاج الخلوي قبل السريري. تتمثل ميزة هذا البروتوكول في أنه قوي ويولد خلايا متجانسة يتم الاحتفاظ بها في نظام استزراع سهل الاستخدام وخالي من Xeno ومحددا كيميائيا بالكامل.

نظرا لأن خلايا iPS البشرية تلخص الخلفية الجينية للأنسجة المانحة ويمكن تمييزها إلى أي نوع من الخلايا ذات الصلة بالمرض ، فإنها توفر أدوات ممتازة لنمذجة الأطروحة. يعتبر تشريح الخزعة واختيار المستعمرة من الإجراءات المعقدة. تساعد رؤيتها تؤديها بأيدي من ذوي الخبرة في فهم الإجراءات وتجعل من السهل تكرارها.

وسيتم إثبات الإجراء اليوم هارييت رونهولم وكيلي داي, اثنين من فنيي المختبرات ذوي الخبرة العالية من مرفق iPS الأساسية في معهد كارولينسكا. يمكن تخزين عينات خزعة الجلد في PBS بالإضافة إلى 1٪ بنسلين ستربتومايسين لمدة تصل إلى 48 ساعة عند أربع درجات مئوية ، ولكن يجب معالجتها في أسرع وقت ممكن بعد الحصول عليها. انقل الخزعة إلى طبق 35 ملم.

اغمر خزعة الجلد في طبق 35 ملم مع ملليلترين من 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية. أضف ملليلترا واحدا من محلول الملح المتوازن المعقم من هانك المكمل بستربتومايسين البنسلين بنسبة 1٪ إلى طبق جديد مقاس 35 ملم وانقل الخزعة إلى الطبق الجديد. انقل الخزعة إلى أربعة أطباق سعة 35 ملم مملوءة بملليلتر واحد من محلول 0.1٪ متباين طازج.

باستخدام المشارط والملقط الجراحي المعقم ، قم بتقطيع خزعة الجلد إلى قطعة من واحد إلى ملليمترين مكعبين. انقل قطع الخزعة مع محلول التباعد إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وأضف ملليلترين إضافيين من التباعد. اشطف الطبق مقاس 35 ملم بملليلتر واحد من محلول التباين وانقل المحلول المغسول إلى أنبوب سعة 15 مل.

احتضان الخزعة عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، أضف أربعة ملليلتر من 0.1٪ كولاجيناز I إلى الأنبوب مع قطع الخزعة واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. قبل ثلاثين دقيقة من بذر الخلايا ، قم بتغطية بئر واحدة في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار مع مليلتر واحد من 0.1٪ جيلاتين في DPBS.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد أربع ساعات من الحضانة بالكولاجيناز ، قم بالطرد المركزي للخلايا المهضومة عند 300 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الهضم في ملليلترين من وسط الخلايا الليفية.

قم بإزالة محلول الجيلاتين من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار المعدة مسبقا. انقل تعليق الخلية بما في ذلك أي قطع نسجية متبقية إلى اللوحة المكونة من ستة آبار. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الرطوبة العالية.

الليفية جاهزة للمرور إلى قارورة زراعة الأنسجة T25 عندما تتماسك بنسبة 80٪. تعتبر الخلايا الليفية عند المرور من الثاني إلى الرابع مثالية لإعادة البرمجة نظرا لأن كفاءة إعادة البرمجة أعلى بشكل عام بالنسبة للأرومات الليفية ذات الممر السفلي. استنشق وسط زراعة الخلية من القارورة واغسل الخلايا بملليلتر واحد من DPBS.

استنشق DPBS وأضف ملليلتر واحد من 0.5٪ Trypsin EDTA. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى تنفصل الخلايا. أضف ملليلترين من وسط الخلايا الليفية ، وأعد تعليق الخلايا ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

جهاز طرد مركزي عند 300 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من وسط الخلايا الليفية. بعد عد الخلايا الليفية باستخدام مقياس الدم، تزرع البذور خمس مرات في 10 إلى الخلايا الرابعة في بئر واحد من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، نظرا لأنه سيتم التعامل مع فيروس سينداي ، استمر في الإجراء في مختبر BSL-2 المخصص مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة. استنشق وسط زراعة الخلية وأضف 250 ميكرولتر من محلول فيروس سينداي.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية. قبل يوم واحد من قطف المستعمرات ، قم بإعداد ألواح زراعة الأنسجة المطلية ب 24 بئرا من LN-521. ماصة 250 ميكرولتر من محلول LN-521 في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا.

أغلق اللوحة باستخدام البارافيلم واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استنشق محلول LN-521 من بئر واحد من اللوحة المكونة من 24 بئرا وأضف 500 ميكرولتر من E8 في البئر. يوصى باستخدام قناع الشعر والإجراء أثناء اختيار المستعمرات تحت المجهر الاستريو.

تكون المستعمرات جاهزة للقطف عندما يصل قطرها إلى أكثر من ملليمتر واحد ، وتعرض حوافا حادة ، وتنمو في طبقات أحادية متجانسة. لا تختار مستعمرات ذات حدود غامضة وكتل خلايا كبيرة غير متجانسة غير مضغوطة. قطع كل مستعمرة بمشرط إلى قطع أصغر بنمط يشبه الشبكة.

استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لكشط صفائح الخلايا ميكانيكيا من الطبق ثم انقل الصفيحة إلى بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا مطلية مسبقا ب LN-521. يعد اختيار المستعمرة أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. سيضمن اختيار عدد قليل من المستعمرات الإضافية التعلق بأعداد كافية.

اسمح للخلايا بالالتصاق دون تغيير وسيط E8 لمدة 48 ساعة. تمر الخلايا إنزيميا عندما يصل حجم المستعمرات إلى أكثر من خمسة ملليمترات. استنشق وسط زراعة الخلايا من الخلايا واغسله ب 250 ميكرولتر من DPBS.

استنشق DPBS وأضف 250 ميكرولتر من كاشف التفكك. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. لاحظ أن الخلايا قد بدأت في التقريب.

افصل الخلايا عن اللوحة عن طريق شطف الخلايا بكاشف التفكك. أضف 500 ميكرولتر من وسط E8 إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وانقل الخلايا وكاشف التفكك إلى الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 مرة جم لمدة ثلاث دقائق.

استنشق المادة الطافية من أنبوب 15 مليلتر وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من وسط E8. عد الخلايا باستخدام مقياس الدمى والبذور 2.5 إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة في بئر آخر محضر مسبقا LN-521 يحتوي على 500 ميكرولتر من وسط درجة حرارة الغرفة E8. أضف مثبط ROCK إلى التركيز النهائي البالغ 10 ميكرومولار.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. باستخدام هذا البروتوكول ، تظهر مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان من الخلايا الليفية المنقولة في حوالي اليوم 12 بعد التنبيغ. كانت المستعمرات جاهزة للانتقاء في حوالي ثلاثة إلى أربعة أسابيع بعد التنبيغ.

تشمل الميزات المفضلة كتل الخلايا المدمجة المسطحة ، والنمو كطبقات أحادية متجانسة ، وحواف حادة. تظهر صور المجال الساطع هذه ممر مبكرا متجانسا ومعاد برمجته بالكامل لخط خلايا iPS البشري مقارنة بخط خلية غير متجانس للغاية. تم تأكيد فقدان ناقل فيروس سينداي من خلال عدم وجود علامات خاصة بناقلات فيروس سينداي في خلايا iPS البشرية عند الممر 12 على عكس خلايا iPS البشرية عند المرور الثالث

أسفرت تلطيخ كيمياء الخلايا المناعية للخلايا المشتقة لعلامات تعدد القدرات OCT4 و SSEA-4 و NANOG عن نتيجة إيجابية متجانسة. تم عرض تعبير mRNA للجينات متعددة القدرات الذاتية بواسطة PCR للنسخ العكسي. تم التخلص من المزارع الخلوية التي تحتوي على خلايا معاد برمجتها جزئيا والتي لا تعبر عن عوامل تعدد القدرات.

تم تقييم إمكانات التمايز لخلايا iPS البشرية عن طريق تكوين أجسام جنينية. اكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بعد 21 يوما من تمايز الجسم الجنيني تعبير mRNA للأديم الباطن والأديم المتوسط والعلامات الخاصة بالأديم الظاهر مما أكد أن خلايا iPS البشرية المشتقة كانت قادرة على التمايز إلى الطبقات الجرثومية الثلاث. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية بحوالي 22 ساعة من التدريب العملي خلال فترة زمنية تبلغ حوالي 16 أسبوعا.

يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان إلى أي نوع من الخلايا في جسم الإنسان البالغ للإجابة على أي أسئلة ذات صلة بمجال البحث الخاص بك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ الخطوات اللازمة لاشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من خزعات الجلد.