"تحليل حيود من العيش" على أساس فورييه ايليجانس كاينورهابديتيس

الهدف العام من تحليل الحيود القائم على فورييه هو توصيف حركة C elegans في الوقت الفعلي حيث تتحرك الأنواع بحرية في مساحة ثلاثية الأبعاد. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب من خلال وصف استجابات الأنواع للكثافات المختلفة للمحلول أو الطفرات الحركية. تعمل هذه الطريقة كخط أساس لتحليل فورييه للأنواع المجهرية.

لديها ميزة أن كل نوع مجهري سيكون له طيف فورييه الفريد الخاص به. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لحركة C elegans ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن العثور على الديدان الخيطية في الكوفيت ، تحت شعاع الليزر قد يكون أمرا صعبا.

خطرنا لأول مرة فكرة هذه الطريقة في محاولة التعرف على سلوك السباحة من إشارة الحيود الزمني ، وهي إشارة صاخبة في حد ذاتها. للبدء ، قم بتأمين ليزر نيون الهيليوم بالقرب من الزاوية اليسرى الخلفية من طاولة العمل البصرية وقم بتوصيله بمصدر طاقة. ضع مرشح كثافة محايد بين الليزر وموقع العينة ، بحيث ينتقل شعاع الليزر عبر المرشح قبل الوصول إلى العينة.

باستخدام مرآتين توجيهيتين من الألومنيوم ذات السطح الأمامي ، قم ببناء منظار عن طريق تأمين المرآة الأولى بعد مرشح الكثافة المحايدة. بعد ذلك ، قم بتأمين المرآة الثانية على بعد حوالي 10 سم أسفل المرآة الأولى لإفساح المجال لتوجيه شعاع الليزر. أدخل كوفيت بين المرايا وقم بمحاذاة شعاع الليزر والكفيت بحيث ينتقل شعاع الليزر عموديا عبر الكوفيت.

بعد ذلك ، قم بتأمين الصمام الثنائي للصور مباشرة مقابل المرآة الثانية بحيث يواجه المستشعر الخاص به المرآة. ثم ضع كوفيت مملوء بالماء على حامل. اضبط ارتفاع الحامل وزوايا المرايا الأول والثاني بحيث ينتقل شعاع الليزر عبر الكوفيت ويتم توجيهه بالقرب من الصمام الثنائي للصور ولكن ليس مباشرة إليه.

استخدم ذراعا للتأكد من أن الحامل يشكل سطحا مستويا للكوفيت. إذا لم يكن الحامل مستويا ، فقم بإجراء التعديلات المناسبة حتى يتم تسويته. أخيرا ، قم بتوصيل الصمام الثنائي للصور براسم الذبذبات الرقمي باستخدام كابل USB المرفق وقم بتوصيله بالكمبيوتر.

قم بتحميل برنامج راسم الذبذبات واضبط معدل العينة على ثمانية هرتز على الأقل لحل دورة سلة المهملات للدودة بشكل كاف. استخدم معول سلك بلاتيني رفيع ومسطح لنقل أربع ديدان نيماتودا بالغة إلى صفيحة بتري جديدة مملوءة ب NGM أجار. بعد ذلك ، قم بإزالة الكوفيت البلاستيكي القابل للتصرف من عبوته ، مع الحرص على لمس الكوفيت فقط على جوانبها المموجة.

بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة لتحويل الماء المقطر إلى كوفيت حتى تمتلئ الكوفيت بنسبة 80٪ تقريبا بالماء المقطر. ضع طبق بتري الذي يحتوي على C elegans تحت نطاق تشريح. بعد ذلك ، استخدم معول البلاتين لإزالة واحدة من C elegans الناضجة من طبق بتري وغمر المعول في الكوفيت.

حرك المعول في دوائر لإخراج الديدان الخيطية إذا لزم الأمر. تعامل مع الديدان الخيطية برفق ولا تهز الكوفيت. قد يؤدي هز الكوفيت إلى عدم استجابة الديدان.

لمنع تكون الفقاعات في الكوفيت ، املأ الكوفيت بالماء المقطر حتى يتزحزح قليلا فوق سطح الكوفيت. ثم املأ الغطاء بالماء وضع الغطاء بسرعة على الكوفيت. باستخدام ورق العدسة، قم بإزالة أي قطرات ماء قد تكون قد انسبكت على الكوفيت.

بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ورق العدسة لإزالة أي قطرات صغيرة متبقية. قم بتشغيل ليزر النيون الهيليوم واضبط إعداد التردد بحيث ينتج شعاعا أحمر. ثم قم بتشغيل المستشعر.

أمسك الكوفيت على جوانبها المموجة وقم بإمالتها برفق حتى تصبح الديدان الخيطية في وسط الكوفيت تقريبا. بعد ذلك ، ضع الكوفيت على الحامل في النظام البصري ، مع توسيط الدودة داخل شعاع الليزر الذي ينتقل من المرآة الأولى إلى المرآة الثانية. بعد ذلك ، ضع الصمام الثنائي للصور في نمط الحيود بحيث لا يتطابق موقع الصمام الثنائي للصور والحد الأقصى المركزي لنمط الحيود.

بعد ذلك ، قم بتدوير مرشحات الكثافة المحايدة بحيث يكون هناك خرج جهد ملحوظ من الصمام الثنائي للصورة. تأكد من الحد من الضوء باستخدام مرشح الكثافة المحايدة ، لمنع الصمام الثنائي للصور من التشبع. يشير الخط المسطح إلى التشبع المفرط أو نقص الشدة.

بمجرد أن يصبح نمط الحيود المتحرك مرئيا ، اجمع البيانات باستخدام الصمام الثنائي للصور من خلال النقر على زر البدء في البرنامج ، والتحكم في راسم الذبذبات أثناء مراقبة حركة الدودة. استمر في أخذ القياسات حتى تتحرك الدودة خارج شعاع الليزر ويختفي نمط الحيود. إذا تم خدش الكوفيت ، تخلص منه وعن الدودة وابدأ من جديد.

بعد حوالي 20 ثانية ، أوقف عملية جمع البيانات بالنقر فوق زر الإيقاف في برنامج راسم الذبذبات. احفظ بيانات كل نسخة تجريبية بقيمة مفصولة بفواصل أو تنسيق نصي. اجمع ما لا يقل عن 50 مجموعة بيانات لكل نمط ظاهري واستخدم ثمانية إلى 10 في كل تجربة.

عرض أمثلة على حركة الدودة المتسلسلة النموذجية وأنماط الحيود المقابلة هنا. تشبه أنماط الحيود النموذجية نوعيا الأنماط التجريبية وتشير إلى أن المحاكاة نجحت في نمذجة الديدان الخيطية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إظهار توقيع الحيود الزمني للأسطوانة والنوع البري من الناحية الكمية.

كما هو موضح هنا ، تضرب كل ديدان خيطية بمعدلات وسعات مختلفة. يسمح متوسط تحويلات فورييه الرقمية بتحديد الديدان الخيطية من خلال اتساع طيف تردد حيودها. يهيمن على طيف الدودة من النوع البري ترددات أقل من طيف حركة الأسطوانة.

فيما يلي مثال على التذبذب w الذي يمكن اعتباره حركتين بحركيتين متعارضتين. في المقابل ، ستشكل الأسطوانة في الغالب حرف c إلى جانب واحد وتظهر هكذا. عند فحص الترددات ، تكون حركة w أكثر تعقيدا ، حيث تكشف عن ترددات منخفضة ثانوية أكثر من الحركة c.

بمجرد إتقان ، يمكن جمع مجموعة بيانات واحدة في حوالي دقيقتين إذا تم تنفيذ التقنية بشكل صحيح. يستغرق إعداد البصريات لسلسلة من مجموعات البيانات حوالي 20 إلى 30 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع C elegans بعناية ، وذلك للحفاظ على سلامة حركتهم.

باتباع هذا الإجراء ، يمكننا تطبيق طرق أخرى مثل إعادة بناء الجرار والتحليل غير الخطي لمعرفة المزيد عن حركة C elegans. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم الأعصاب لدراسة الطفرات الحركية بمزيد من العمق في C elegans. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء أنماط حيود للديدان الخيطية الحية وكيفية تحليلها.

لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل عدم انتقال الليزر على مستوى العين أثناء تنفيذ الإجراء.