Name: اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: تعلم بروتوكولاً فعالاً لاشتقاق خطوط الخلايا الجذعية الجنينية من أجنة الفئران في مرحلة الكيسة الجرثومية باستخدام الخلايا الليفية الجلدية كخلايا مغذية. يحقق هذا الأسلوب كفاءات عالية تصل إلى 78% في التوليد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نشكر لوكاس Jonatan له المساعدة التقنية مع تغذية الخلية والثقافة، سيرفي استابولاري de la اتحاد المصارف العربية لرعاية الحيوان ومارتن دومينيك لتسجيل الفيديو. حظي بدعم هذا العمل من الوزارة دي ايكونوميا y AGL2014 كومبيتيتيفيداد-52408-R ودي محافظة كاتالونيا SGR 2014-524. بعثة التحقق المشتركة مستفيدة زمالة PIF-اتحاد المصارف العربية.

استخدام الحيوانات في المقاطع أدناه قد تم وافقت عليها "لجنة الأخلاقيات" في الحيوان والإنسان البحث جامعة برشلونة المستقلة ود خلية &#39; الصيد الزراعة، راماديريا، وأنا Alimentació من محافظة كاتالونيا (بروتوكول #8741).
 1-تغذية الخلية المنظمة والتخزين ملاحظة: القلفة البشرية الليفية (الأكايمية-1) كانت مجمدة في السابق في 1 مل من محلول التجميد التي تتكون من 90% مصل بقرى الجنين (FBS) و 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( [دمس]) وتخزينها في النتروجين السائل حتى استخدام.
<ol><li>ذوبان الجليد قنينة مبردة من الأكايمية-1 (1 مل) من غمر القنينة في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة محتويات القنينة المبردة المذابة إلى دولبيكو المعالجون مسبقاً &#39; s النسر التعديل &#39; s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% FBS لجعل 01:10 إضعاف.</li>
	<li>بذور الخلايا المخفف (10 مل) في قارورة T75 والثقافة لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	تغيير <li>في اليوم التالي، على المديين المتوسط والقضاء على البقايا [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.</li>
	الثقافة في هفس <li>وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة حتى يصل إلى الثقافة مرحلة المتلاقية. قد يستغرق هذا الأمر حوالي 7 إلى 10 أيام.</li>
	<li>لإعداد حل المنظمة، وتمييع mitomycin C في دميم وتستكمل مع 10% FBS بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. احتضان الخلايا مع حل المنظمة ح 3 في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>إزالة حل المنظمة وشطف الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من هانكس متوازن الملح الحل (حبس) للقضاء على فلول ميتوميسين ج.</li>
	<li>لفصل الخلايا المعطل، إضافة 1 مل من قبل حرارة يدتا التربسين الحل واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب التأكد من أنها منفصلة (الهدف العاشر 10 مع 0.3 الفتحة العددية أو NA). إذا لم تكن كذلك، احتضان منهم لبضع دقائق إضافية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2. فحص الخلايا مرة أخرى تحت المجهر المقلوب.</li>
	<li>"الماصة؛" الحل مع ماصة باستور كي ننأى بكتل الخلية.</li>
	<li>تحييد الحل الانزيمية بإضافة 4 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS وريسوسبيند-</li>
	تأخذ قاسمة لتعليق خلية <li>وجعل إضعاف 1: 100 في حبس. لتحديد عدد الخلايا، تحميل 10 ميليلتر لتمييع في نويباور &#39; s الدائرة. عد الخلايا الموجودة في إحدى الساحات الكبيرة الدائرة بموجب مجهر مقلوب (الهدف x 20 مع نا 0.45).
	<ol><li>تكرار العد في مجموعة من أربعة مربعات كبيرة. حساب إجمالي عدد الخلايا (ن) كنون = متوسط عدد الخلايا معدود x الحجم الإجمالي x تمييع x 10 4-</li>
	</ol></li> <li>الطرد المركزي بقية العينة لمدة 5 دقائق في 200 x غ. تجاهل المادة طافية وبيليه مع تجميد الحل بتركيز 10 6 خلايا كل مل ريسوسبيند.</li>
	<li>قاسمة التعليق في قنينات المبردة مع 10 6 خلايا (1 مل) كل. ضع قارورة المبردة في حاوية تجميد وتجميد في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>في اليوم التالي، تخزين القنينات المبردة في النتروجين السائل-</li>
</ol> 2. وحدة تغذية "الخلية والثقافة" <ol><li>واحد إلى أربعة أيام قبل البدء في عملية الاشتقاق، إبطال ذوبان قنينة مبردة التي تتضمن 1 × 10 6 خلايا الأكايمية-1 في حمام مائي في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>جعل إضعاف 1:6 1-الأكايمية المذابة في تسخينها قبل دميم وتستكمل مع 10% FBS والحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ملء كل بئر من صفيحة 4-جيدا مع 500 ميليلتر من قبل حرارة 0.2 ٪ الجيلاتين من جلد الخنزير والاحتفاظ باللوحة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10</li>
	إزالة 500 ميليلتر من الجيلاتين من الآبار <li>وإضافة 500 ميليلتر لتمييع هفس. روك بلطف لوحة لضمان توزيع هفس في الجزء السفلي من الآبار بصورة موحدة. تجنب حركات دائرية، خلاف ذلك سوف تركز الخلايا في مركز البئر.</li>
	<li>احتضان لوحة مالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحصول على المونولاير هفس المعطل في كل بئر-</li>
	مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب (الهدف العاشر 10 مع نا 0.3) <li>في اليوم التالي، والتحقق من أنها تعلق والبلوتينيوم الموزعة. تغيير وسيلة للقضاء على فلول [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 500 ميليلتر من دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.</li>
</ol> 3. جمع الجنين والثقافة <ol><li>أربعة أيام قبل جمع الأجنة، وإدارة 5 وحدات دولية من الفرس الحامل &#39; s المصل تروج عن طريق الحقن داخل للفئران الإناث 6-12 أسبوع القديمة. 
	ملاحظة: لقد استخدمنا الإناث من 129S2 أو من سلالات B6CFAF1، على الرغم من أن يمكن استخدام الإناث من سلالات الماوس الأخرى. ومع ذلك، عند العمل مع الإناث من سلالات غير المتساهلة (مثلاً CBA)، المتوسطة ينبغي أن تستكمل مع 2 طاء كما هو مذكور في الخطوة 4، 2-</li>
	<li>بعد 48 ساعة، إدارة 5 وحدات دولية من الإنسان المشيمية تروج عن طريق الحقن داخل، وتتزاوج الإناث مع الذكور، على الأقل 8 أسابيع من العمر، بنسبة 1:1. فصل الإناث عن الذكور في اليوم التالي-</li>
	إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع عدة قطرات ميليلتر 40 كسوماج المتوسطة وتستكمل مع 4 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA) <li>اليوم قبل جمع الأجنة، وملء اللوحة مع الزيوت المعدنية تغطية كامل القطرات. احتضان الطبق على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حجته المتوسطة-</li>
	<li>لإعداد الماصات التلاعب بالأجنة، حرارة الجزء أرق من الزجاج طويلة ذات الرؤوس ماصة باستور استخدام موقد بنسن. بمجرد لينة، وسحبها من اللهب وسحب طرفي عن بعضها البعض. كسرها إلى الطول المطلوب. يجب أن يكون القطر الداخلي في تلميح 100-150 ميكرومتر.</li>
	<li>Euthanize الفئران الإناث بخلع عنق الرحم ح 45-48 وظيفة-كويتوم (p.c.).</li>
	<li>تشريح الفئران لفضح تجويف البطن بقطع الجلد مع منحنى سلس مقص حاد والصفاق مع مقص حاد مستقيم. انتزاع الرحم واحد مع الملقط وقطع قناة استخدام مقص حاد مستقيم، ووضعه في كزب مخزنة حبيس المتوسطة (هكزب) 13 في 37 درجة جيم تكرار العملية لإزالة في قناة أخرى.</li>
	<li>دافق أوفيدوكتس مع حقنه 1 مل محملة هكزب الذي عقد في مكان بالملقط الساعاتي لجمع الأجنة 2-خلية- 
	ملاحظة: إعداد تأخذ إبرة التنظيف إبرة حقن 30 غ، قطع النهاية، والبرية إلى تلميح صراحة على حجر جلخ.</li>
	<li>باستخدام أجهزة ماصة الفم، التقاط الأجنة وغسلها في هكزب والثقافة لهم في الطبق الثقافة الجنين المجهز سابقا على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حتى مرحلة الكيسة. ما يصل إلى 50 الأجنة يمكن أن يكون مثقف في كل قطره 40 ميليلتر. رصد التنمية الجنين كل 24 ساعة تحت ستيريوميكروسكوبي. 
	ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأجنة يمكن جمعها في مرحلة الكيسة لتقصير الثقافة الجنين في المختبر. وفي هذه الحالة، euthanize الإناث في يوم p.c. 3.5-4.5، تشريح الرحم. وتدفق عليه مع هكزب-</li>
</ol> 4. اشتقاق الخلايا الجذعية <ol><li><ol><li>من إعداد لوحات الاشتقاق في اليوم من زرع الجنين، إعداد المتوسطة الاشتقاق بتكميل المتوسطة دميم مع 100 ميكرومتر 2-β ميركابتوثانول، 1 x "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم ، 20% لاستبدال المصل، و 10 3 U/mL ليف.</li>
		<li>إذا رغبت في ذلك، أيضا إضافة 1 ميكرومتر من مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 و 3 ميكرومتر مثبطات GSK3 CHIR99021 للحصول على متوسط 2 طاء-</li>
		<li>تأخذ لوحة 4-جيدا مع أحادي الطبقة هفس المعطل (الخطوة 2، 6) من حاضنة. إزالة المتوسطة وإضافة 800 ميليلتر من الاشتقاق قبل حرارة متوسطة لكل بئر. العودة اللوحة للحاضنة.</li>
	</ol></li> <li>إزالة Zona pellucida والجنين البذر <ol><li>إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع قطرات ثلاث 30 ميليلتر من تيرودي الحمضية &#39; s الحل 14 وقطرات ثلاث 30 ميليلتر من المتوسطة الاشتقاق. تغطية القطرات مع الزيوت المعدنية وإبقاء الطبق على 37 درجة مئوية.</li>
		<li>أخذ الطبق الثقافة الجنين من الحاضنة. واحداً تلو الآخر، نقل بلاستوسيستس من قطرات الثقافة إلى تيرودي حمضية &#39; s حل انخفاض استخدام ماصة تلاعب الأجنة. إذا كان ذلك ممكناً، حدد فقط blastocysts الموسعة لبدء عملية الاشتقاق.</li>
		<li>مراقبة الهضم zona pellucida تحت ستيريوميكروسكوبي. حالما يختفي بيلوسيدا زونا، نقل الكيسة إلى انخفاض متوسط اشتقاق من أجل تغسل تيرودي الحمضية &#39; حل s-</li>
		<li>تأخذ لوحة الاشتقاق 4-جيدا من حاضنة والبذور واحدة خالية من زونا الكيسة على وحدة التغذية خلايا في كل بئر-</li>
		<li>عودة لوحة الاشتقاق 4-جيدا للحاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	</ol></li> <li>تغير نمو الخلايا الجذعية الرصد والمتوسطة <ol><li>رصد ثقافات كل 24 ساعة تحت مجهر مقلوب (الهدف X 20 مع نا 0.45). من المهم ملاحظة ما إذا كانت هناك علامات على تمايز الخلايا الجذعية، مثل تورم الخلايا الانكسار المحيطة بثمرة أو حتى دفع التغذية الخلايا جانبا.</li>
		<li>كل يوم، تغيير وسيلة للثقافة. تأخذ اللوحة 4-جيدا من الحاضنة وإزالة المتوسطة من كل بئر وإضافة 800 ميليلتر من المتوسطة اشتقاق المعالجون قبل استكمالها مع ليف و 2 طاء، إذا ما استخدمت. الحفاظ على الثقافة حتى هي لاحظت أووتجرووثس (6-8 أيام)-</li>
	</ol></li></ol> 5. زراعة الخلايا الجذعية وصيانة <ol><li>تحضير يشار تشبه مقابض والماصات التلاعب بالخلايا الجذعية. اتبع الخطوة 3.4 بإعداد الماصات التلاعب بالخلايا الجذعية مع قطر داخلي في غيض من 250-300 ميكرون. استخدم الجزء الآخر من ماصة باستور سحبت لإعداد المؤشر مثل يشار. الحرارة والشكل حتى الحصول على هوك-</li>
	<li>لوحة الثقافة 4-جيدا خارج الحاضنة وتحديد موقع ثمرة تحت ستيريوميكروسكوبي. استخدم المقبض لدفع بعيداً الخلايا المتمايزة ومغذيات التي تحيط ثمرة. 
	ملاحظة: لتجنب التفريق في نهاية المطاف من ثمرة، من المهم لإزالة جميع الخلايا المتمايزة من الحافة من ثمرة.</li>
	<li>نضح ثمرة مع ماصة تلاعب خلايا الجذعية، ووضعه في طبق جديد في قطره 50 ميليلتر التربسين-يدتا.</li>
	<li>استخدام مشرط لقطع ثمرة في عدة أجزاء من أجل تفصيل ذلك ميكانيكيا وانزيماتيكالي على السواء-</li>
	<li>على الفور، نقل أجزاء ثمرة إلى قطره جديدة من الاشتقاق المتوسطة لتحييد عمل التربسين.</li>
	<li>نقل أجزاء ثمرة لصفيحة 4 آبار جديدة مع أحادي الطبقة مغذيات. نقل الأجزاء يصل إلى 10 في كل بئر والثقافة لهم مع اشتقاق المتوسطة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>الحفاظ على الثقافات الشبيهة بالخلايا الجذعية لمدة ستة أسابيع على الأقل قبل النظر في السطر مسك المنشأة. تغيير المتوسط كل يوم وثقافة فرعية أخرى منها مرة واحدة في أسبوع-</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

على الرغم من أن مسك خط الاشتقاق إجراء معروفة تستخدم بشكل روتيني في العديد من المختبرات، كفاءتها ليس دائماً مرتفعا كما هو متوقع بسبب العوامل المتعددة التي يمكن أن تخل بصيانة بلوريبوتينسي. في هذه المادة ونحن إظهار، خطوة بخطوة، كيفية إنشاء خطوط مسك بكفاءة عالية باستخدام بروتوكول بسيط ويمكن الاعتماد عليها. هذه الفعالية مماثلة لتلك التي ذكرت في الأدبيات.
لضمان أقصى قدر من الكفاءة، من المهم مراقبة الخلايا يوميا أو مرة كل يومين، منذ الساعة النقاط التي أشارت إلى توضيحية فقط. من الضروري تجنب فرط المستع...

الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) هي pluripotent الخلايا المشتقة من الأجنة بريمبلانتيشن، التي تحتفظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت ظروف محددة1. وبناء على هذه الخصائص، أصبحت ESC أداة مفيدة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والأنسجة الدراسات الهندسية2.
استمدت ESC للمرة الأولى من الأجنة الماوس preimplantation، تنشأ خطوط ESC (مسك) الماوس مع النجاح منخفضة3،4. لسنوات، ظلت كفاءة اشتقاق منخفضة نظراً لصعوبة الحفاظ على بلوريبوتينسي في المختبر. وإلى جانب ذلك وجود تغذية الخلايا5، مما يحسن كفاءة الاشتقاق، وتعزيز مرفق مستعمرة والاستقرار كاريوتيبيك6، عدة تعديلات للبروتوكول يؤدي إلى حدوث تحسن في الصيانة بلوريبوتينسي. كانت أهم الإضافة من اللوكيميا المثبطة عامل (LIF) إلى مسك الثقافة المتوسطة7،8، استخدام الأجنة من الخلفية الدلالية 129S29 وثقافة مسك مع المتوسطة وتستكمل مع تعريف المصل، خالية من عوامل التمايز المحتمل10. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الأدلة الدامغة أن إضافة خليط من اثنين المغيرون جزيء صغير من مسارات الإشارات إلى مسك الثقافة المتوسطة (المعروفة باسم 2i) أفضل وسيلة للحفاظ على بلوريبوتينسي. 2 طاء كوكتيل يتكون من مجموعة المانع مجاهدي خلق PD0325901، مما يقلل من إشارات التمايز عن طريق تثبيط بروتين mitogen تنشيط المسار كيناز (MAPK)، ومثبطات GSK3β CHIR99021، مما يعزز بقاء الخلية في منخفض الكثافة بتنشيط مسار Wnt11.
في هذه المادة، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لكفاءة استخلاص خطوط ©جميع من blastocysts الماوس. ونحن اتباع الإجراءات القياسية، استزراع الأجنة من سلالات متساهلة في تغذية الخلايا في اشتقاق المتوسطة وتستكمل مع ليف و استبدال مصل12. يمكن اشتقاق عقب هذا البروتوكول، ومسك خطوط مع الكفاءات المماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في المتوسط 2 طاء. وعلى الرغم من ذلك، يمكن إضافة 2 طاء لتجنب المشاكل المحتملة مع الحفاظ على بلوريبوتينسي أو عند العمل مع سلالات غير متساهلة.

<table><tbody><tr><td>1 مل sryringe</td><td>BD & nbsp ؛</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&>-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>محلول التيرود الحمضي&nbsp;</td><td>محلية الصنع</td><td></td><td>انظر الوصفة في Nagy et al ، 2003. للتخزين قصير الأجل (حتى شهر واحد) احتفظ به عند 4 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، للتخزين طويل الأجل ، احتفظ به عند -20 درجة مئوية. إذا تضاءلت كفاءة المحلول ، فيجب تحمضه عن طريق إضافة قطرة صغيرة من حمض الهيدروكلوريك 1M.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>الدجاج المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 488</td><td>مجسات جزيئية - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1: 500 التخفيف. الجسم المضاد الثانوي للأجسام المضادة للفأر Oct4 و Tuj1 و alpha و AFP.</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>إعادة التكوين مع 2.15 مل DMSO لكل ملغ من المسحوق ، للحصول على محلول مخزون 1 ملليمتر. Aliquot بالحجم المطلوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان.</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>قم بإلغاء تنشيطه قبل استخدامه عن طريق التسخين لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية Aliquot وتخزينه في -20 & ordm ؛ C</td></tr><tr><td>إبرة التنظيف</td><td>BD & nbsp ؛</td><td>304000</td><td>قطع نهاية الإبرة وطحنها إلى طرف غير حاد على حجر كاشطة</td></tr><tr><td>الجيلاتين من جلد الخنازير</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>تمييع بنسبة 0,2٪ في الماء المقطر والأوتوكلاف. يمكن استخدام كل تخفيف لمدة شهر.</td></tr><tr><td>الماعز المضادة للأرانب IgG ، Alexa Fluor 594</td><td>المجسات الجزيئية - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1: 500 التخفيف. الجسم المضاد الثانوي للجسم المضاد للأرانب Sox2.&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-buffered CZB&nbsp;</td><td>محلي الصنع</td><td></td><td>انظر التكوين في Chatot et al، 1989</td></tr> موجهة <tr><td>الغدد التناسلية المشيمية البشرية</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>تمييع في كلوريد الصوديوم 0.9٪ عند 50 وحدة دولية / مل. Aliquot في 1 مل وتخزينها في -20 & ordm. C لمدة تصل إلى شهرين. بمجرد إذابتها لا تتجمد مرة أخرى.</td></tr><tr><td>الخلايا الليفية للقلفة البشرية</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>للتخزين طويل الأجل ، يوصى بتخزينها في النيتروجين السائل.</td></tr><tr><td>KnockOut مصل استبدال</td><td>تقنيات الحياة</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>حساسة للضوء. يوصى بتخزينه بكميات صغيرة مثل 10 مل وتخزينه في -20 & ordm; ج (تحقق من تاريخ انتهاء الصلاحية). تجنب دورات التجميد والذوبان. &nbsp; &nbsp;</td></tr>مكمل <tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>مع 4 مجم / مل BSA. التوازن عند 37 & ordm; C و 5٪ CO2 في اليوم قبل الاستخدام.</td></tr><tr><td>عامل مثبط سرطان الدم ميرك</td><td>ميليبور</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>الفئران &nbsp;</td><td>نهر تشارلز / هارلان</td><td></td><td>يوصى باستخدام الفئران من سلالة متساهلة من حيث اشتقاق mESC (مثل 129S2 أو C57BL). ومع ذلك ، فإن سلالات زواج الأقارب أقل كفاءة في إنتاج الأجنة. لذلك ، يوصى باستخدام سلالة هجينة ، مثل 129S2 x C57BL أو B6CBAF1 للاستفادة من القوة الهجينة.</td></tr><tr><td>تم اختبار الزيوت المعدنية</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo. حساسة للضوء.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>إعادة تكوين المسحوق بماء MilliQ بمعدل 0.5 مجم / مل. C محمي من الضوء. انتبه, أنها ضارة ويشتبه في أنها تسبب السرطان.&nbsp;</td></tr><tr><td>الفأر المضادة للتوبولين & III (Tuj1)</td> <td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1: 500 تخفيف</td></tr><tr><td>الماوس أحادي النسيلة مضاد لألفا ؛ SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1: 200 تخفيف</td></tr><tr><td>الماوس أحادي النسيلة المضاد ل AFP</td><td>R & D أنظمة</td><td>MAB1368</td><td>1:50 تخفيف</td></tr><tr><td>الماوس أحادي النسيلة المضاد Oct3 / 4 &nbsp ؛</td><td>سانتا كروز</td><td>SC-5279</td><td>1:50 تخفيف</td></tr><tr><td>الأحماض الأمينية غير الأساسية</td><td>تقنيات الحياة</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>إعادة التكوين مع 2.08 مل DMSO لكل ملغ من المسحوق ، للحصول على محلول مخزون 1 مل. Aliquot بالحجم المطلوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان.</td></tr><tr><td>طبق بتري (35 مم)</td><td>صحن بتري 153066</td><td></td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>Nunc (60 مم)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>مصل الفرس الحامل موجهة الغدد التناسلية</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>مخفف في كلوريد الصوديوم 0.9٪ عند 50 وحدة دولية / مل. Aliquot في 1 مل وتخزينه في -20 & ordm; C لمدة تصل إلى شهرين. بمجرد إذابتها لا تتجمد مرة أخرى.</td></tr><tr><td>أرنب بوليكلونال مضاد ل Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1: 200 تخفيف</td></tr><tr><td>T75 فالكون</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>تمييع 1:10 في HBSS للحصول على محلول 1x</td></tr></tbody></table>

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الماوس هو العملية التي pluripotent هي أنشأت خطوط الخلايا من الأجنة preimplantation. هذه الخطوط الاحتفاظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت شروط معينة. بسبب هذه الخصائص، يتم مسك أداة مفيدة في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، ودراسات هندسة الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول بسيط للحصول على خطوط مسك مع اشتقاق عالية الكفاءة (60-80 في المائة) باستزراع blastocysts من سلالات الماوس متساهلة في تغذية الخلايا في المعرفة المتوسطة وتستكمل مع العوامل المثبطة اللوكيميا. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول كفاءة استخلاص خطوط ©جميع من سلالات الماوس غير متساهلة، بإضافة بسيطة من خليط من اثنين مثبطات جزيء صغير إلى متوسط الاشتقاق (متوسط 2 طاء). وترد الإجراءات المفصلة في إعداد والثقافة لتغذية الخلايا، جمع وثقافة الأجنة الماوس، واشتقاق والثقافة من خطوط ©جميع. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن تنفذ في أي مختبر خبرة الثقافة الأساسية خلايا الثدييات.

في أعقاب هذا البروتوكول، ما يزيد على 95% تكوين ثمرة يجب أن يتحقق بعد الأسبوع الأول من الثقافة (الشكل 1A). إنشاء خطوط ©جميع بعد ستة ممرات متغيراً بين replicates التجريبي، مع نجاح متوسط من 60-80%. إضافة 2 طاء لا يحسن إلى حد كبير النتائج عند العمل مع سلالات الماوس المتساهلة، مثل تلك التي مع خلفية 129S2، ولكن من الضروري عند العمل مع سلالات غير متساهلة.
المستعمرات ESC الماوس ينبغي أن يقدم مورفولوجيا عادي...

توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

تعد الخلايا الجذعية خلايا متعددة القدرات ومتخصصة، وتتميز بقدرتها على التجدد الذاتي على المدى الطويل وقدرتها على إنتاج خلايا متمايزة من الطبقات الجرثومية الثلاث في ظل ظروف معينة. وبفضل هذه الخصائص، تمتلك الخلايا الجذعية إمكانات هائلة في الطب التجديدي، ونمذجة الأمراض، والهندسة الحيوانية. لسنوات عديدة، كانت خطوط الخلايا الجذعية الجنينية المخصصة لأغراض البحث تُشتق بشكل أساسي من أجنة الفئران، ولكن بشكل عام كانت كفاءات الاشتقاق التي تم تحقيقها منخفضة.في هذا الفيديو، نعرض بروتوكولاً بسيطاً لاشتقاق خطوط خلايا جذعية جنينية للفئران باستخدام ظروف قياسية توفر كفاءات اشتقاق عالية ومعقولة، تضاهي الكفاءات التي يتم الحصول عليها عند استخدام معدلات مسارات الإشارات، مثل 2i. في هذا البروتوكول، سنستخدم الخلايا الليفية من القلفة البشرية كخلايا مغذية لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية واستزراعها. وقبل البدء في عملية اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية، من الضروري تثبيط نشاط الخلايا المغذية.أولاً، خذ أنبوباً مبرداً يحتوي على أرومات ليفية من القلفة البشرية مخزنة في النيتروجين السائل، وقم بإذابته عن طريق غمر الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. وبمجرد الإذابة، خفف المحتوى في وسط DMEM مضاف إليه مصل جنين البقر. ازرع التخفيف في دورق Falcon، وازرعه حتى يصل إلى مرحلة الاندماج. بعد ذلك، ولتثبيط نشاط الأرومات الليفية، خفف مادة mitomycin C في وسط DMEM مضاف إليه مصل جنين البقر، ثم حضن الخلايا لمدة ثلاث ساعات في محلول التثبيط هذا.بعد ذلك، قم بإزالة محلول التعطيل واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول هانكس الملح المتوازن (Hanks'Balanced Salt Solution) للتخلص من بقايا الميتومايسين ج (mitomycin C). ولفصل الخلايا المغذية المعطلة، أضف ملليلتر واحد من محلول trypsin-EDTA واحضن الخلايا لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، افحص الخلايا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من انفصالها عن قارورة المزرعة.بعد ذلك، يتم سحب الخلايا باستخدام ماصة باستور لتفكيك تكتلات الخلايا، ثم يتم تحييد المحلول الإنزيمي بإضافة أربعة ملليلتر من DMEM المدعم بمصل جنين البقر. يتم أخذ عينة صغيرة وتخفيفها في محلول ملحي، ثم تحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور. وبالتوازي مع ذلك، يتم طرد بقية العينة باستخدام جهاز الطرد المركزي.تخلص من السائل الطافي، وقم بتخفيف الراسب في محلول التجميد بتركيز نهائي يبلغ مليون خلية لكل مليلتر. قسم المعلق إلى أجزاء متساوية في أنابيب حفظ مبردة. وأخيرًا، ضع الأنابيب المبردة في حاوية تجميد واحفظها عند درجة حرارة -80 °C. وفي اليوم التالي، قم بتخزينها في النيتروجين السائل.قبل بدء عملية الاشتقاق بيوم إلى أربعة أيام، خذ أنبوب تجميد يحتوي على خلايا مغذية غير نشطة ومخزنة في النيتروجين السائل وأذبها في حمام مائي عند 37 °C. بعد ذلك، خفف الخلايا في وسط DMEM مُدفأ مسبقاً ومُدعم بمصل الجنين البقري، واستخدم الماصة بلطف لضمان تجانس الخليط. أضف 500 µL من محلول الجيلاتين المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر في طبق مكون من أربعة آبار، واتركه عند 37 °C لمدة 10 دقائق. مباشرة بعد ذلك، قم بإزالة الجيلاتين من كل بئر.أضف 500 µL من تخفيف الخلايا المغذية إلى كل بئر، وهز الطبق برفق لضمان توزيع الخلايا المغذية بشكل متجانس في قاع الآبار. تجنب القيام بحركات دائرية، لأن ذلك سيؤدي إلى تركيز الخلايا في مركز البئر. بعد ذلك، ضع الطبق في الحاضنة عند 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة على الأقل.في اليوم التالي، افحص الخلايا تحت مجهر مقلوب وتأكد من أنها ملتصقة وموزعة بشكل تام. وأخيراً، استبدل الوسط الغذائي للخلايا المغذية بوسط DMEM دافئ مسبقاً ومضاف إليه مصل جنين البقر لإزالة بقايا DMSO. وقبل جمع الأجنة، حفز عملية التبويض المفرط لدى إناث الفئران عن طريق حقن خمس وحدات دولية من هرمون GtN المأخوذ من مصل الفرس الحامل وهرمون HCG في التجويف البريتوني بفاصل زمني قدره 48 ساعة.قم بتزويج الإناث مع الذكور، ثم افصلهم بعد 24 ساعة. ولجمع الأجنة في مرحلة الخليتين، قم بقتل الإناث رحيمًا بعد 48 ساعة من الجماع، وقم بتشريح الفئران الإناث للحصول على قناتي فالوب وجزء قصير من قرون الرحم، ثم ضعها في طبق يحتوي على وسط CZB المنظم بـ HEPES. بعد ذلك، قم بغسل قناتي فالوب واحدة تلو الأخرى باستخدام وسط CZB المنظم بـ HEPES تحت المجهر الستيريو لجمع الأجنة.انقل الأجنّة في مرحلة الخليتين إلى طبق استنبات تم تحضيره في اليوم السابق باستخدام عدة قطرات من وسط استنبات الأجنّة المغطى بالزيت المعدني. احتفظ بالأجنّة في الحاضنة حتى الوصول إلى مرحلة الكيسة الأرومية. راقب تطور الأجنّة كل 24 ساعة.من المتوقع أن تصل الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأرومية بعد 48 ساعة من بدء الزرع في المختبر. إذا كان ذلك ممكناً، اختر فقط الكيسات الأرومية المتوسعة لبدء عملية الاشتقاق. وفي يوم استزراع الأجنة، قم بتحضير الوسط الخاص باشتقاق الخلايا الجذعية.أضف عامل تثبيط لويكيميا، أو LIF، إلى وسط DMEM المدعم بـ 2-beta-mercaptoethanol والأحماض الأمينية غير الأساسية وبديل المصل KnockOut. إذا رغبت في ذلك، أضف مثبط MAPK ومثبط GSK-3 للحصول على وسط 2i. أخرج الطبق ذو الأربع آبار الذي يحتوي على الطبقة أحادية الخلايا من الخلايا المغذية من الحاضنة.أزل الوسط، وأضف 800 µL من وسط الاشتقاق المُحضّر حديثاً. وقبل استزراع الكيسات الأرومية على الخلايا المغذية، يجب إزالة المنطقة الشفافة. وللقيام بذلك، انقل جنيناً واحداً من طبق الزرع إلى قطرة من محلول Tyrode الحمضي وأبقهِ فيها حتى يتم هضم المنطقة الشفافة.تأكد من إزالة المنطقة الشفافة بالكامل عن طريق ضبط التركيز والتباين في المجهر الستيريو. بعد ذلك، اشطف الجنين الخالي من المنطقة الشفافة بعدة قطرات من وسط الاشتقاق ثم ازرعه على طبقة أحادية من الخلايا المغذية. كرر العملية مع بقية الأجنة.قم بتحضين الطبق عند 37 °C و5% carbon dioxide. راقب المزارع كل 24 ساعة باستخدام مجهر مقلوب لتقييم نموها وتحديد العلامات المبكرة المحتملة للتمايز، مثل الخلايا المنكسرة المنتفخة التي تحيط بالنمو أو حتى التي تدفع الخلايا المغذية جانباً. قم بتغيير وسط المزرعة كل يومين.للقيام بذلك، أخرج طبق الأربعة آبار من الحاضنة، وقم بإزالة الوسط من كل بئر، ثم أضف 800 µL من وسط الاشتقاق الذي تم تدفئته مسبقاً والمكمل بـ LIF و 2i في حال استخدامهما. أعد الأطباق إلى الحاضنة، وحافظ على المزرعة حتى تظهر النموات الخارجة. بعد ستة إلى ثمانية أيام من استزراع الكيسة الأرومية، يجب أن يظهر نمو خارجي، ويجب حينها إجراء استزراع فرعي له.لهذا الإجراء، يلزم توفير مقابض شبيهة بـ cull وممصات لمعالجة الخلايا الجذعية. ولصنعها، خذ مصاصة باستور ذات طرف طويل وسخن جزأها الأكثر نحافة باستخدام موقد بنزن. وبمجرد أن تلين، اسحب المصاصة بعيداً عن اللهب واجذب الطرفين بعيداً عن بعضهما حتى ينفصلا.استخدم الجزء الأكثر سمكاً بماسورة لمعالجة الخلايا الجذعية. قم بتسخين طرف الجزء الأكثر نحافة، وقم بتشكيله حتى يتم الحصول على خطاف لإعداد مقبض يشبه أداة القلع. ولإجراء استزراع فرعي للنمو الخارج، حدد موقعه باستخدام المجهر الستيريو.بمساعدة المقبض، قم بإزاحة الخلايا المتمايزة التي تحيط بالنمو الخارجي. ولتجنب حدوث تمايز لاحق، من المهم توخي الدقة عند إزالة الخلايا المتمايزة من حافة النمو الخارجي. وباستخدام ماصة لمناولة الخلايا الجذعية، قم بشفط النمو الخارجي ووضعه في قطرة من محلول trypsin-EDTA المسخن مسبقاً.باستخدام المشرط، قم بتقطيع النتوء إلى عدة قطع لتفكيكه ميكانيكيًا وإنزيميًا. استرجع شظايا النتوء، وضعها في قطرة من وسط الاشتقاق المسخن مسبقًا من أجل تحييد مفعول التريبسين. وأخيرًا، ازرع شظايا النتوء في طبق رباعي الآبار يحتوي على طبقة أحادية من الخلايا المغذية، وقم باستزراعها في وسط الاشتقاق عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide.يجب الحفاظ على مزارع الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية لمدة ستة أسابيع على الأقل قبل اعتبار خط ESC مؤسساً. وخلال هذه الفترة، من الضروري تغيير الوسط المزرعي كل يومين وإجراء عملية الاستزراع الفرعي مرة واحدة في الأسبوع. ومع زيادة أرقام الممرات، يتغير شكل المستعمرات تدريجياً من الشكل القبي، ليصبح شكلاً أكثر استطالة وتسطحاً.بعد ستة ممرات، تعبر خطوط الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mouse ESC) بشكل تأسيسي عن علامات تعدد القدرات، مثل Oct 4 و Sox 2. علاوة على ذلك، بعد تحفيز التمايز المختبري للخلايا الجذعية الجنينية عن طريق زراعتها في وسط DMEM المدعم بـ 10% مصل بقري جنيني وبدون خلايا مغذية، يمكن الكشف عن علامات التمايز الممثلة لطبقات الجنين الثلاث بواسطة التألق المناعي. هنا، نبين الكشف عن بروتين anti-tubulin beta-3 كعلامة للأديم الظاهري، و alpha-smooth muscle actin للأديم المتوسط، و alpha-fetoprotein للأديم الباطني.باتباع هذا الإجراء البسيط، يمكن اشتقاق خلايا جذعية جنينية من الكيسات الأريمية للفئران بكفاءات تتراوح من 60% إلى 78%. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم فحص الخلايا يومياً أو كل يومين لأن التوقيتات المذكورة هنا هي مجرد أمثلة توضيحية. وفي حال نمو مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية بشكل مفرط، فإنها تصبح داكنة اللون بسبب تراكم الخلايا وتميل إلى التمايز بسهولة أكبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لعملية اشتقاق واستزراع الخلايا الجذعية الجنينية للفئران باستخدام الظروف القياسية.

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

تفاصيل هذا البروتوكول اشتقاق زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) ، والحقن في وقت لاحق في الفئران المتلقي المشع القاتلة. باختصار ، كانت متباينة ESC كهيئات مضغي الشكل ، والذي يصاب بعد ذلك مع HoxB4 فيروسات وشارك في تربيتها مع OP9 الخلايا اللحمية والسيتوكينات المكونة للدم.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

قدرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لتجديد الذات وتميز في جميع أنواع الخلايا في الجسم يشير إلى أن لديهم وعدا كبيرا للتطبيقات الطبية والبحوث كأداة لمعالجة المسائل الأساسية في التنمية والمرض. هنا ، ونحن نقدم موجزة ، خطوة بخطوة بروتوكول لاشتقاق خلايا جذعية جنينية من أجنة من جراء العزلة immunosurgical من كتلة الخلايا الداخلية.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

قدرة الخلايا الجنينية جرثومي على التمايز إلى خلايا جرثومي البدائية خلال مراحل النمو المبكر هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في الأجنة 10،5-11،5 أيام آخر coitum الماوس.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

في هذا الفيديو ، ونظهر عزلة blastocysts الماوس واشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية blastocysts. وصفنا أيضا الظروف الملائمة لصيانة الممتلكات الخلايا الجذعية ، وكذلك الحث التمايز في الثقافة.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (اللجنة التوجيهية) تنتج خطوط خطوط مختلفة المحتملة التنموية حتى عندما تمر الاختبارات القياسية لتعدد القدرات. نحن هنا وصف بروتوكول لإنتاج الفئران المستمدة كليا من iPSCs، الذي يحدد الخطوط التوجيهية وتعدد القدرات الكاملة...

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

ويرد طريقة بسيطة لاستخلاص والحفاظ الجذعية الظروف المناسبة وخطوط الخلايا السلف من الفئران البالغة هنا. الأسلوب يستخدم الخلايا المغذية القادمة من المقصورة الخلية الجسدية للخصية الفأر الكبار. هذه التقنية قابلة للتطبيق على سلالات الفئران شيوعا، بما في ذلك المعدلة وراثيا، خارج المغلوب، وتدق في الفئران.

مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

في السنوات الأخيرة وقد تجلى تشكيل الخلايا الجرثومية باستخدام أساليب الثقافة في المختبر باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية الجسدية. هذه المادة سوف يقدم بصريا التفريق بين الأطفال حديثي الولادة الماوس الخلايا الجذعية المشتقة إلى أوائل الخلايا الشبيهة البويضة.

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

يمكن تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر  إلى الخلايا التائية في المختبر باستخدام نظام الزراعة المشتركة OP9-DL1. يتطلب النجاح في هذا الإجراء اهتماما دقيقا بصيانة الكاشف / الخلية ، والخطوات الرئيسية الحساسة للتقنية. نناقش هنا هذه المعلمات الهامة ونقدم بروتوكولا مفصلا لتشجيع اعتماد هذه التكنولوجيا.

اشتقاق خلايا T في المختبر من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمية، وحيدة الخلية في التحليل الموقعي للتعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في أجنة الفئران قبل الغرس. الإجراءات اللازمة لتحصيل الكيسات الأريمية، بكل جبل كشف مناعي للبروتينات، وصفت التصوير العينات على المجهر متحد البؤر، وتجزئة النووية وتحليل الصور.

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

تهدف هذه المقالة إلى إظهار استخدام الخلايا الجذعية الجنينية الهيمونوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء أجنة شبه مستنسخة.

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

تعلم بروتوكولاً فعالاً لاشتقاق خطوط الخلايا الجذعية الجنينية من أجنة الفئران في مرحلة الكيسة الجرثومية باستخدام الخلايا الليفية الجلدية كخلايا مغذية. يحقق هذا الأسلوب كفاءات عالية تصل إلى 78% في التوليد.

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات