في فيفو التصوير المتعدد الوسائط، وتحليل للماوس المستحثة بالليزر طراز نيوفاسكولاريزيشن تشورويدال

تُعد العمليات الوعائية الجديدة سمة مميزة للعديد من الأمراض العينية الشائعة، وأبرزها التنكس البقعي المرتبط بالسن النضحي، أو Wet AMD اختصاراً، واعتلال الشبكية السكري التكاثري، واعتلال الشبكية لدى الخداج. وتشكل هذه الاضطرابات مجتمعة معظم حالات العمى القانوني في جميع أنحاء العالم، وترتبط بمضاعفات عينية إضافية، مثل النزيف الزجاجي والمياه الزرقاء الوعائية الجديدة.

ومع ذلك، وعلى الرغم من انتشارها، تظل الخيارات العلاجية لاضطرابات التوعي الدموي العيني محدودة. ويتمثل معيار الرعاية الحالي للتوعي الدموي المرتبط بالتنكس البقعي المرتبط بالسن (AMD) واعتلال الشبكية السكري التكاثري في الحقن داخل الجسم الزجاجي لأجسام مضادة مأنسنة موجهة ضد وسيط حاسم في عملية تكوين الأوعية الدموية والتوعي الدموي، وهو عامل نمو البطانة الوعائية أو VEGF. ولكن، وبالرغم من الفعالية في وقف تطور المرض وتحسين الرؤية الوظيفية، فإن الحقن داخل الجسم الزجاجي مكلفة وليست خالية من المخاطر.

يمكن أن تشمل المضاعفات الإصابات العدوائية، والتهاب داخل المقلة، وانفصال الشبكية، والنزيف العيني. لذا، هناك حاجة ملحة لتطوير خيارات علاجية جديدة تكون فعالة وآمنة وأقل تكلفة. ومن أجل دفع عجلة تطوير الأدوية لعلاج الاضطرابات الوعائية الحديثة، تكتسب نماذج الحيوانات الصغيرة أهمية بالغة.

يجب أن تكون هذه النماذج قابلة للتكرار، وأن تمتلك قراءات ونقاط نهاية محددة وموثقة، ومن المثالي أن تستخدم مركباً مرجعياً ذا صلة سريرية ليكون بمثابة ضابط موجب. سنعرض في هذا البروتوكول نموذج التوعي الحديث المشيمي في الفئران، أو نموذج CNV، وهو أحد أكثر النماذج استخداماً لدراسة الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تساهم في حدوث CNV وتطوير عوامل جديدة مضادة للتوعي الحديث. في نموذج CNV، يتم تمزيق غشاء Bruch باستخدام ليزر الأرغون.

مما يؤدي إلى بدء عمليات تكوّن أوعية دموية جديدة تنشأ من المشيمية. ويوفر استخدام التصوير الطولي الحي عبر التصوير المقطعي المتساند بصرياً في المجال الطيفي، أو SD-OCT اختصاراً، وتصوير الأوعية بالفلوريسين، وسيلة لمتابعة تكاثر وتراجع CNV. وبذلك، يمكن تقييم فعالية والجدول الزمني للتدخلات الدوائية الجديدة.

علاوة على ذلك، تتيح التطورات الحديثة في معالجة الصور إمكانية التقسيم الآلي لقياس سماكة الشبكية، مما يوفر منهجية خالية من تحيز الباحث لتقييم وجود الوذمة. سنناقش هنا فائدة برنامج InVivoVue Diver الجديد من شركة Leica Microsystems للتقسيم الآلي لطبقات الشبكية في نموذج CNV لدى الفئران. وأخيرًا، سنناقش كيف يمكن للتحليل النسيجي للعينات الكاملة من الشبكية أن يكمل التصوير الطولي داخل الجسم الحي في هذا النموذج.

توضع قطرة واحدة من tropicamide في كل عين لتوسيع حدقة العين. بعد ذلك، يوضع الحيوان برفق في مرحلة محاذاة القوارض. يتم ضبط وضعية الفأر لكشف العين وتثبيته باستخدام حامل الأنف وقطعة من الشريط اللاصق المختبري توضع برفق فوق الظهر.

بعد ذلك، يتم وضع قطرة من المزلق على العين للترطيب، ويتم إزالة أي سائل زائد بعناية باستخدام مسحات من ورق الترشيح. وأخيراً، يتم محاذاة المنصة أمام جهاز OCT لإجراء تصوير OCT المرجعي. يتم إجراء تصوير المقطع العرضي البصري في النطاق الطيفي (spectral-domain optical coherence tomography) داخل الجسم في المرحلة المرجعية، وذلك قبل تطبيق الليزر، للتحقق من عدم وجود أي تشوهات في الشبكية.

أخرج الفأر برفق من الحامل. ضع قطرة واحدة من Viscotears Gel على شريحة غطاء لتسطيح القرنية. وجه الفأر بحيث يكون رأس العصب البصري في المركز، وركز شعاع الليزر على الظهارة الصبغية للشبكية.

قم بإجراء ثلاث نبضات ليزر مع تجنب الأوعية الدموية الشبكية عند مواضع الساعة الرابعة والثامنة والثانية عشرة حول العصب البصري. افحص صلابة العين بعد جميع نبضات الليزر للتأكد من عدم وجود أي نزيف شبكي. وكما سبق، قم بمحاذاة الفأر في الحامل وأجرِ تصوير الأوعية بالفلوريسين وتصوير المقطع العرضي البصري (OCT) لتأكيد تضرر غشاء بروك.

بالنسبة لتصوير الأوعية بالفلورسين، قم أولاً بضبط التركيز على مناطق الحرق بالليزر باستخدام وضع الانعكاس بالأشعة تحت الحمراء، والذي يسمح بتحديد المواقع التي تم فيها تطبيق الليزر. احقن بعناية 0.1 milliliters من ملح الصوديوم للفلورسين بتركيز 5%، لكل 20 grams تقريباً من وزن جسم الفأر دون تغيير وضعية عين الفأر. ابدأ في التقاط صور تصوير الأوعية بالفلورسين على مستوى المشيمية وعلى مستوى الشبكية، كل 30 seconds تقريباً.

قم بمحاذاة العين للتصوير المقطعي للترابط البصري (OCT) كما سبق وابدأ التصوير. يساعد حساب متوسط إشارة SD-OCT في تحسين رؤية المورفولوجيا التفصيلية للشبكية، كما هو موضح في هذا التسلسل. بمجرد الانتهاء من تصوير SD-OCT، قم بإخراج الفأر من الحامل بعناية.

ضع المادة الم lubricant لكلتا العينين. في هذه المرحلة، يمكنك اختيار عكس التخدير عن طريق الحقن تحت الجلد لمضاد alpha-2 للميديتوميدين، وهو أتيباميزول، أو الانتظار حتى يستعيد الحيوان وعيه من التخدير. كرر تصوير SD-OCT و FA في الجسم الحي للحيوانات المخدرة في أيام المتابعة الخامسة والعاشرة والرابعة عشرة.

استخدم ميزة التجزئة الآلية في برنامج InVivoVue Diver لقياسات سمك الشبكية. بالنسبة للشبكية السليمة، يُعتبر إجمالي سمك الشبكية هو سمك جميع الطبقات، بدءاً من طبقة الألياف العصبية وصولاً إلى الظهارة الصباغية للشبكية (RPE). وفي الشبكية السليمة، يمكن للتجزئة الآلية تحديد الطبقات الفردية للشبكية بدقة، كما هو موضح في هذا المثال.

ومن الجدير بالذكر أنه في المواضع التي يتواجد فيها تدمير وعائي Choroidal (CNV)، يجب إجراء قياس يدوي لسماكة الشبكية لكل موقع من مواقع آفات CNV على حدة، وذلك من طبقة الألياف العصبية إلى خط وهمي يمر عبر طبقة الظهارة الصباغية للشبكية (RPE). يوضح هذا التسلسل سير العمل لعمليات قياس السماكة اليدوية في المواضع التي توجد بها آفات CNV.

تقع طبقة الألياف العصبية في الأعلى، والمشيمية في أسفل الصورة. باستخدام الماوس أو لوحة اللمس، يتم تحديد حدود طبقة الألياف العصبية والمشيمية يدوياً، ويقوم البرنامج تلقائياً بحساب السماكة الكلية للشبكية بناءً على هذه الإحداثيات. يوضح هذا الشكل صوراً متسلسلة تم التقاطها كل 20 ثانية عند مستوى المشيمية.

تم الحصول على الصورة الأولى في وضع الانعكاس بالأشعة تحت الحمراء، بينما تم الحصول على الصور الأخرى بعد الحقن الصفاقي للفلوريسين. تشير الأسهم البيضاء في الصورة الأولى إلى المواقع التي تم تعريضها لليزر، والتي تظهر تسرباً للفلوريسين في نقاط زمنية لاحقة، وهو ما توضحه الأسهم البيضاء في الصورة 18.

تظهر هذه الصورة تصويراً تسلسلياً بفلوروسين الصوديوم (FA) تم الحصول عليه على مستوى الشبكية. يشير السهم الأبيض في الصورة 18 إلى موقع تم تعريضه لليزر، والذي يظهر تسرباً للفلوروسين بشكل أسرع من الموقعين الآخرين المحددين بدوائر في الصورة 18. يوضح هذا الشكل الملخص التسلسل الزمني لصور التصوير المقطعي المتسق البصري ذو النطاق الطيفي (SD-OCT).

عند نقطة الأساس، ومباشرة بعد استخدام الليزر، ونقاط المتابعة الزمنية في الأيام الخامس والعاشر والرابع عشر. وباختصار، فإن بروتوكول التصوير الطولي الحي لآفات CNV باستخدام تصوير SD-OCT وFA يتيح التصنيف السريع ومتعدد الأنماط والموثوق لباثولوجيا CNV ووجود الوذمة الشبكية. نشكركم على اهتمامكم.