تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص مكتبات الجزيئات الصغيرة بحثا عن العوامل التي تعزز التمايز النجمي في الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية السرطانية ، مثل مسارات الإشارات المطلوبة للحفاظ على الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي في الحالة غير المتمايزة. يسمح التنفيذ السليم لهذه التقنية بالتعرف المباشر على الجزيئات الصغيرة التي تعزز تمايز الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج الورم الأرومي الدبقي Ehlers-Danlos لأن تقليل النسبة المئوية للخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي قد يقلل من احتمالية تكرارها. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تعيين التمايز إلى سلالات خلوية أخرى باستخدام بنيات مراسل أخرى. تقريرنا هو الأول من نوعه الذي يضع نهجا عالي الإنتاجية للكشف عن العوامل التي تجبر الخلايا الجذعية للورم الدبقي على التمايز.

يمكن أن يكون العمل مع جزيئات الفيروسات العدسية في الخلايا السرطانية المشتقة من المرضى خطيرا للغاية. لذلك يجب دائما اتباع الإجراء القياسي للعمل مع مسببات الأمراض المنقولة بالدم. للبدء ، قم بزرع مليون خلية جذعية من الورم الأرومي الدبقي أو GSCs في ملليلترين من وسط نمو الخلايا الجذعية العصبية الكامل في صفيحة من ستة آبار.

بعد ذلك ، قم بتحويل الخلايا باستخدام مراسل الفيروسات العدسية في تعدد العدوى يساوي خمسة. إلى خليط الخلية والفيروسات ، أضف ميكرولترين من البوليبرين بحيث يكون التركيز النهائي ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، استبدل وسط النمو لإزالة الفيروس غير المرتبط.

وخلايا الطرد المركزي عند 360 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم قم بشفط الخلايا المتوسطة والصفيحية بعناية مرة أخرى في طبق من ستة آبار. واستمر في احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.

حصاد 0.5 مل من إجمالي حجم الثقافة. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 360 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في وسط نمو الخلايا الجذعية العصبية الطازجة سعة 0.5 ملليلتر.

ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة للسماح بالتمدد لمدة 72 ساعة على الأقل. أضف 200 ميكرولتر من كاشف التفكك واحتضنه لمدة خمس دقائق في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية. قم بفصل الخلايا عن طريق التمرير لأعلى ولأسفل برفق.

أضف إلى الخلايا المنفصلة 800 ميكرولتر من HBSS لضمان الحد الأدنى من ارتباط الخلايا أو تجميعها. بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر من كل معلق خلية إلى آبار من لوحة 96 متعددة الآبار. تحديد النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر عن طريق قياس التدفق الخلوي.

سجل ما لا يقل عن 10,000 خلية قابلة للحياة في كل عملية اكتساب. في جميع التحليلات الخلوية للتدفق ، استخدم الخلايا الأبوية غير المنقولة أو الخلايا غير الفلورية المنقولة بالنواقل لإنشاء مضان خط الأساس. لتحديد وتوسيع الخلايا البذرية الفردية بكثافة 0.7 خلية لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية العصبية في صفيحة 96 بئرا.

حافظ على هذه المستنسخة في الثقافة لمدة 11 يوما. ابحث عن المجالات العصبية التي يزيد قطرها عن 100 ميكرون. لقد حددنا سابقا حجم القطع هذا لتحديد ما إذا كان الغلاف الخلي قد نشأ بواسطة خلية جذعية للورم الأرومي الدبقي ذاتية التجديد.

قد يحتاج حجم القطع هذا إلى تحسين عند العمل مع نماذج مختلفة لخلايا الورم الأرومي الدبقي. راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري المجهز بمرشح FITC وقم بتمييز الآبار التي تحتوي على غلاف عصبي واحد يكون فيه ما يقرب من 1٪ إلى 5٪ من الخلايا إيجابية GFP. بعد وضع العلامات ، قم بتوسيع المستنسخة الفردية حتى يتوفر عدد كاف من الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي.

بافتراض أن استنساخ المراسل يحتوي على 1٪ إلى 5٪ من الخلايا الإيجابية ل GFP ، قم بحصاد 0.5 مل من كل استنساخ جنبا إلى جنب مع كمية متساوية من خلايا التحكم غير المنقولة لتحديد النسبة المئوية الدقيقة للخلايا الإيجابية ل GFP. بعد تكوير الخلايا عند 360 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من كاشف التفكك إلى كل حبيبات واحتضان الأنابيب في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، قم بتقطيع الخلايا حوالي 20 إلى 30 مرة لتحقيق تعليق خلية واحدة. ثم أضف 800 ميكرولتر من HBSS لضمان الحد الأدنى من ارتباط الخلايا أو تجميعها. الآن انقل 200 ميكرولتر من كل معلق خلية إلى آبار من لوحة متعددة الآبار 96.

أخيرا ، قم بإجراء قياس التدفق الخلوي ، وتسجيل ما لا يقل عن 10،000 خلية قابلة للحياة في كل عملية اكتساب. لتقييم القدرة الاستنساخية ، قم بإعداد معلقات أحادية الخلية من الاستنساخ الفرعي لمراسل التمايز عن طريق خلية الخلايا حوالي 20 إلى 30 مرة. ثم قم بتقطيع هذه الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا الجذعية العصبية الكامل بكثافة حوالي خمس إلى 500 خلية لكل بئر في 96 لوحة متعددة الآبار.

حافظ على هذه الخلايا في المزرعة لمدة تسعة إلى 11 يوما. ابحث عن المجالات العصبية تحت المجهر الضوئي. يعتبر البئر الذي يحتوي على غلاف عصبي كبير واحد على الأقل إيجابيا.

بالنظر إلى الخلايا الأبوية غير المحولة والخلايا المنقولة بفيروس العدسات الإيجابية ل GFP كعناصر تحكم ، فإن إجمالي الآبار التي تم تحليلها وعدد الخلايا الإيجابية على واجهة ELDA عبر الإنترنت. لبدء الفحص ، قم بوضع 5000 خلية في 99 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا الجذعية العصبية الكامل في صفيحة مكونة من 96 بئرا. ثم باستخدام ماصة ذات 12 قناة ، عالج الخلايا بتركيزين نهائيين من مركبات المكتبة المخففة أو باستخدام عنصر تحكم DMSO.

احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة. أضف الآن 150 ميكرولترا من كاشف تفكك الخلايا باستخدام ماصة ذات 12 قناة في كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتقطيع الخلايا في كل بئر برفق حوالي 20 إلى 30 مرة باستخدام ماصة ذات 12 قناة حتى يتم تحقيق تعليق خلية واحدة.

الآن قم بإجراء قياس التدفق الخلوي وتحديد النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن مراسل GFAP: GFP. أولا ، حدد حجم الخلية وقابليتها للبقاء من المبعثر الأمامي والجانبي وقم ببوابة مجموعة الخلايا القابلة للحياة. ثم حدد الخلايا الإيجابية ل GFP داخل مجموعة الخلايا القابلة للحياة.

زيادة النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP بمقدار ثلاثة انحرافات معيارية على الضوابط ضربة إيجابية يمكن تعديلها لاستيعاب تفضيل المستخدم للصرامة. يتم عرض صور تمثيلية للنسخ الفرعية HSR-GBM1 GSC التي تعبر عن مستويات منخفضة وعالية من GFAP: GFP. تم اختيار الاستنساخ الفرعي الإيجابي لتعبير GFAP: GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي لخط الغلاف العصبي المشتق من المريض.

هنا ، يشير GFAP: GFP المنخفض إلى أن أقل من 5٪ من الخلايا في الاستنساخ إيجابية GFP ، بينما يشير GFAP: GFP المرتفع إلى أن أكثر من 75٪ من الخلايا في الاستنساخ إيجابية ل GFP. تظهر هذه النتائج أن قدرة التجديد الذاتي في المختبر للاستنساخ الفرعي المنخفض GFAP أعلى من نظيراتها عالية من GFAP على النحو الذي تحدده ELDA. لذلك ، تكون استنساخ GH الفرعية أكثر تمايزا من استنساخ GL الفرعي.

أخيرا ، تم فحص مكتبات الأدوية لتحديد العوامل القادرة على إحداث التمايز الفلكي في GSCs. تم العثور على 12 دواء لزيادة النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن مراسل GFAP: GFP بشكل كبير. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسابيع قليلة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل اختبار alamarBlue ، والمقايسة الاستمغنائية في الوسائط شبه الصلبة ، والجناح أو حقن xenograph داخل الجمجمة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثير الأدوية الانتقائية على التكاثر الخلوي والتماثر في المختبر والأورام في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد المركبات القادرة على إحداث التمايز الفلكي في الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي.