التعريفي للشلل وإصابة النظام المرئي في الفئران التي تي الخلايا المحددة للبصري المياليني أقوابورين أوتوانتيجين-4

تتمثل الأهداف العامة لهذا البروتوكول في تحفيز الجهاز العصبي المركزي أو أمراض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي عن طريق النقل بالتبني للخلايا التائية الخاصة بالأكوابورين 4 ، ومراقبة التأثيرات الناتجة على الجهاز العصبي المركزي والنظام البصري الديناميكي. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بدور أكوابورين 4 ، المعروف باسم AQP4 ، والخلايا التائية المحددة في التهاب النخاع البصري بالإضافة إلى الاضطرابات البصرية الالتهابية الأخرى. الميزة الرئيسية للتصوير المقطعي للتماسك البصري هي القدرة على إجراء المراقبة الطولية لإصابة الشبكية بطريقة غير جراحية.

سيوضح الإجراء شارون ساجان ، باحث مشارك في مختبري بالإضافة إلى أندرياس كروز هارانز ، زميل في مختبر RE Greens. ابدأ بربط محبس نايلون ثلاثي الاتجاهات مع وصلتين من قفل Luer إلى حقنة قفل Luer زجاجية بدون مكبس. قم بتبديل ذراع المحبس باتجاه المحقنة لإغلاق المحبس ووضع المحقنة بحيث يكون الطرف المفتوح متجها لأعلى.

بعد الدوامة ، أضف حجما واحدا لواحد من الببتيد ، ومحلول Freund's Adjuvant الكامل إلى المحقنة ، وأعد إدخال المكبس الزجاجي في المحقنة. أمسك المكبس في مكانه ، واقلب المحقنة بحيث يكون المحبس متجها لأعلى ، وقم بتبديل الرافعة إلى الوصلة الأنثوية غير المستخدمة. اضغط على المكبس بعناية لإزالة الهواء الزائد من المحقنة.

سيملأ الحل وصلة قفل Luer الذكر الثاني للمحبس. ثم قم بتوصيل حقنة زجاجية ثانية مع المكبس الذي تم إدخاله بالكامل في وصلة قفل Luer الذكر الثانية. لإنشاء مستحلب ، اضغط بالتناوب على الغطاسات لتمرير المحلول بين المحقنتين لمدة دقيقتين تقريبا ، وقم بتبريد المحلول لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يحدث تغيير واضح في لزوجة المحلول.

عندما يتشكل مستحلب أبيض شديد الصلابة ، انقل كل المحلول إلى إحدى المحاقن ، واستبدل المحقنة الفارغة بحقنة قفل Luer جديدة بحجم ملليمتر واحد. املأ المحقنة الجديدة بالمستحلب. قم بإزالة المحقنة من المحبس ، وقم بتوصيل إبرة قياس 25.

لاختبار المستحلب بالماء للتأكد من تناسقه ، قم بطرد قطرة من المستحلب في طبق صغير من الماء. إذا لم يتشتت المستحلب ، فهو مناسب للحقن. ثم حقن كل متبرع بالفأر بالضربة القاضية AQP4 تحت الجلد مرة واحدة في كل جانب من جوانب أسفل البطن ، وفي كل جانب من جدار الصدر الإنسي إلى الإبط.

بعد 10 إلى 12 يوما من التحصين ، قم بعمل شق خط الوسط في الجلد من الفخذ إلى الرقبة ، وأسفل كل ساق من الفأر الأول. اسحب الجلد بعيدا عن الصفاق ، وثبته بإحكام على السبورة. ثم احصد الغدد الليمفاوية الأربية والإبطية ، وضع الأنسجة في مصفاة خلوية داخل طبق بتري يحتوي على وسط كامل.

عندما يتم جمع جميع الغدد الليمفاوية ، ضع مصفاة الخلية على أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على وسط كامل طازج على الجليد ، واستخدم الطرف المسطح لمكبس حقنة معقم سعة خمسة ملليلتر للضغط على خلايا العقدة الليمفاوية من خلال شبكة المرشح. اشطف الشبكة ب 20 إلى 30 مل من الوسط الكامل لتسهيل استعادة الخلية متبوعا بغسلتين بالطرد المركزي. بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق الحبيبات في وسط الخلية التائية للعد.

أضف التركيزات المناسبة من المستضد ، وفأر الإنترلوكين المؤتلف 23 ، والفأر المؤتلف IL-6 إلى الخلايا ، وأضف ملليلترين من الخلايا لكل بئر في خليط الاستقطاب Th17 هذا في كل بئر من صفيحة 12 بئرا. ثم ضع الطبق في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة. في اليوم الثالث من الاستقطاب ، قم بتقطيع الثقافات في كل بئر عدة مرات لإخراج الخلايا المستقطبة ، وتجميعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر على الجليد للعد.

بعد غسلتين في PBS ، قم بتخفيف الخلايا إلى 1 في 10 إلى الخلايا الثامنة لكل تركيز مليلتر في PBS ، واخلط معلق الخلية برفق عن طريق الدوران. في غضون ساعة واحدة من جمعها ، انقل الخلايا إلى حقنة سعة ملليلتر واحد ، وقم بتوصيل 200 ميكرولتر من الخلايا إلى كل متلقي عن طريق الوريد عبر الوريد الذيلي. ثم حقن كل فأر داخل الصفاق على الفور وبعد يومين مع 200 نانوغرام من سم السعال الديكي B المخفف في 200 ميكرولتر من PBS.

بالنسبة لتصوير الشبكية في الجسم الحي للحيوانات المتلقية عن طريق التصوير المقطعي بالتماسك البصري ، قبل خمس دقائق من التصوير ، قم بتوسيع حدقة العين بقطرة واحدة من 1٪ تروبيكاميد لكل عين ، وقم بتشغيل حصيرة الحرارة. ضع الماوس على أسطوانة التصوير ، وأعد توجيه تدفق التخدير وفقا لذلك. احم العينين باستخدام 0.3٪ هيدروكسي بروبيل ميثيل سلولوز للحفاظ على رطوبتها ، ولضمان استمرارية الانكسار ، ووضع عدسات لاصقة مخصصة على العين لفحصها.

مسترشدا بصورة قاع العين بالأشعة تحت الحمراء ، قم بتوجيه الليزر إلى العين المغطاة بالعدسة مع الحرص على أن يتركز الشعاع على رأس العصب البصري. قم بإجراء 25 مسحا ضوئيا B في وضع الدقة العالية ، وقم بتنقيط الصور من 30 مسحا ضوئيا بمتوسط. بعد تصوير كلتا العينين ، استبدل العدسات اللاصقة بهلام العين ، وضع الفأر في قفص تعافي دافئ.

لتحليل الصور المكتسبة باستخدام برنامج التصوير المعياري للتجزئة الآلية ، قم أولا بتصحيح الأجزاء المقابلة للغشاء المحدد الداخلي والطبقة الضفيرية الداخلية يدويا لتمثيل حدود طبقات الشبكية الداخلية. ثم تحقق من أن الألياف العصبية الشبكية وطبقات الخلايا العقدية موجودة داخل حدود طبقة الشبكية الداخلية ، وأنها لا تتداخل. يثير التحصين تحت الجلد باستخدام ببتيدات AQP4 التي تحتوي على حواتم الخلايا التائية المسببة للأمراض استجابات قوية للخلايا التائية التكاثرية في الغدد الليمفاوية المستنزفة للفئران بالضربة القاضية AQP4 مقارنة باستجابات الخلايا التائية من النوع البري.

توضح تحليلات قياس التدفق الخلوي لتعبير بيتا V الفردي أن الخلايا التائية الخاصة بببتيدات AQP4 التي تحتوي على حواتم الخلايا التائية المسببة للأمراض تستخدم ذخيرة TCR فريدة من نوعها ، وتظهر فرط التكاثر الانتقائي الذي يشير إلى أن استجابات الخلايا التائية المسببة للأمراض لهذه المحددات يتم تنظيمها عادة عن طريق الانتقاء السلبي الغدة الصعترية. بعد ما يقرب من ستة إلى تسعة أيام من حقن الخلايا التائية المستقطبة ، طورت جميع الفئران المتلقية تقريبا علامات سريرية لمرض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك الذيل العرج وشلل الأطراف الخلفية. مع الخلايا التائية الخاصة ب TH17 المستقطبة AQP4 التي تسبب مرضا سريريا أكثر خطورة من الخلايا التائية الخاصة ب TH1 المستقطبة AQP4.

على سبيل المثال ، أصيب هذا الفأر بشلل كامل في الأطراف الخلفية بعد إدارة الخلايا التائية الخاصة بالببتيد AQP4 المستقطبة Th17. يرتبط المرض السريري الناجم عن خلايا Th17 الخاصة بالببتيد AQP4 أيضا بتسلل الخلايا أحادية النواة إلى حمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا بالإضافة إلى التهاب العصب البصري كما يتضح من تورم وزيادة سمك طبقة الشبكية الداخلية التي تعود إلى خط الأساس مع تعافي الفئران من المرض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز ومراقبة المناعة الذاتية المستهدفة ب AQP4 ، مما سيسمح بمزيد من الدراسة لفهم كيفية مشاركة الخلايا التائية في التهاب النخاع والعصب البصري.