التعريفي للشلل وإصابة النظام المرئي في الفئران التي تي الخلايا المحددة للبصري المياليني أقوابورين أوتوانتيجين-4

تتمثل الأهداف العامة لهذا البروتوكول في تحفيز مرض مناعي ذاتي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن طريق النقل التبني لخلايا T المتخصصة في أكوابورين 4، ومراقبة التأثيرات الناتجة على الجهاز العصبي المركزي والنظام البصري الديناميكي. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بدور خلايا T المتخصصة في أكوابورين 4، المعروف باسم AQP4، في التهاب النخاع والعصب البصري وكذلك الاضطرابات البصرية الالتهابية الأخرى. تكمن الميزة الرئيسية للتصوير المقطعي للاتساق البصري في القدرة على إجراء مراقبة طولية لإصابة الشبكية بطريقة غير جراحية.

سوف تقوم بشرح الإجراء شارون ساغان، باحثة مشاركة في مختبري، بالإضافة إلى أندرياس كروز هارانس، زميل في مختبر آر إي جرينز. ابدأ بتوصيل صمام إيقاف نايلون ثلاثي الاتجاهات يحتوي على وصلتي Luer lock ذكرين بمحقنة زجاجية ذات وصلة Luer lock بدون المكبس. قم بتحويل رافعة صمام الإيقاف باتجاه المحقنة لإغلاق الصمام، ثم ضع المحقنة بحيث تكون النهاية المفتوحة متجهة للأعلى.

بعد عملية الرج بالدوامة، أضف حجماً متساوياً (بنسبة واحد إلى واحد) من الببتيد ومحلول مساعد فروند الكامل إلى المحقنة، ثم أعد إدخال المكبس الزجاجي في المحقنة. مع تثبيت المكبس في مكانه، اقلب المحقنة بحيث يكون الصمام موجهاً للأعلى، وحول الرافعة إلى الوصلة الأنثوية غير المستخدمة. اضغط المكبس بعناية لإزالة الهواء الزائد من المحقنة.

سيملاً المحلول وصلة لير (Luer lock) الذكرية الثانية في الصمام ثلاثي المسالك. بعد ذلك، قم بتوصيل حقنة زجاجية ثانية مع إدخال المكبس بالكامل في وصلة لير الذكرية الثانية. ولإنشاء المستحلب، اضغط على المكبسين بالتناوب لنقل المحلول بين الحقنتين لمدة دقيقتين تقريبًا، ثم برد المحلول لمدة 10 دقائق تقريبًا حتى يحدث تغير ملحوظ في لزوجة المحلول.

عندما يتكون مستحلب أبيض شديد التماسك، انقل كل المحلول إلى إحدى المحاقن، واستبدل المحقنة الفارغة بمحقنة Luer lock جديدة سعة 1 ملليلتر. املأ المحقنة الجديدة بالمستحلب. ثم انزع المحقنة من الصنبور، وقم بتركيب إبرة مقاس 25-gauge.

لاختبار قوام المستحلب باستخدام الماء، قم بتفريغ قطرة من المستحلب في طبق صغير يحتوي على الماء. إذا لم يتشتت المستحلب، فإنه يكون مناسباً للحقن. بعد ذلك، قم بحقن كل فأر مانح من فئران AQP4 knockout تحت الجلد مرة واحدة في كل جانب من أسفل البطن، وفي كل جانب من جدار الصدر إنسياً بالنسبة للإبط.

بعد 10 إلى 12 يومًا من التحصين، يتم إجراء شق في خط الوسط في الجلد من المنطقة الإربية وصولاً إلى الرقبة، وعلى طول كل ساق للفأر الأول. يتم سحب الجلد بعيدًا عن الصفاق وتثبيته بإحكام على اللوحة. بعد ذلك، تُجمع العقد اللمفاوية الإربية والإبطية، وتوضع الأنسجة في مصفاة خلايا داخل طبق بتري يحتوي على وسط غذائي كامل.

عند الانتهاء من جمع كافة العقد اللمفاوية، ضع مصفاة الخلايا فوق أنبوب مخروطي سعة 50-milliliter يحتوي على وسط غذائي كامل طازج على الثلج، واستخدم الطرف المسطح لمكبس سرنجة معقمة سعة five-milliliter لضغط خلايا العقد اللمفاوية عبر شبكة الفلتر. اشطف الشبكة بـ 20 إلى 30 milliliters من الوسط الغذائي الكامل لتسهيل استعادة الخلايا، يتبع ذلك غسلتان عن طريق الطرد المركزي. بعد عملية الطرد المركزي الثانية، أعد تعليق الراسب في وسط خلايا T لغرض العد.

أضف التركيزات المناسبة من المستضد، وإنترلوكين 23 المأرأب للفئران، وإنترلوكين IL-6 المأرأب للفئران إلى الخلايا، ثم أضف مليليترين من الخلايا في هذا المزيج المستقطب لـ Th17 إلى كل بئر في طبق مكون من 12 بئراً. بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C مع 5%CO2 لمدة 72 ساعة. وفي اليوم الثالث من الاستقطاب، قم بتفتيت المزارع في كل بئر عدة مرات لتحرير الخلايا المستقطبة، ثم اجمعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مليليتر على الثلج من أجل العد.

بعد غسل الخلايا مرتين في PBS، خفف الخلايا لتصل إلى تركيز 1×10⁸ خلية لكل ملليلتر في PBS، واخلط معلق الخلايا بلطف عن طريق التدوير. وفي غضون ساعة واحدة من جمعها، انقل الخلايا إلى سرنجة سعة 1 ملليلتر، ثم احقن 200 µL من الخلايا في كل حيوان مستقبِل عن طريق الوريد عبر وريد الذيل. بعد ذلك، احقن كل فأر داخل الصفاق فوراً ثم بعد يومين بـ 200 ng من B pertussis toxin مخففة في 200 µL من PBS.

لتصوير الشبكية في الجسم الحي للحيوانات المستقبلة باستخدام التصوير المقطعي للاتساق البصري، قم بتوسيع حدقتي العين قبل خمس دقائق من التصوير بوضع قطرة واحدة من tropicamide بتركيز 1% في كل عين، وقم بتشغيل حصيرة التدفئة. ضع الفأر على أسطوانة التصوير، وقم بتوجيه تدفق التخدير وفقاً لذلك. قم بحماية العينين باستخدام hydroxypropyl methylcellulose بتركيز 0.3% للحفاظ على رطوبتهما، ولضمان استمرارية الانكسار، وضع عدسة لاصقة مخصصة على العين المراد فحصها.

بناءً على صورة قاع العين بالأشعة تحت الحمراء، وجه الليزر إلى العين المغطاة بالعدسة مع الحرص على تمركز الشعاع على رأس العصب البصري. قم بإجراء 25 مسحاً من نوع B-scan بوضع الدقة العالية، وقم بمسح الصورات شبكياً من 30 مسحاً من نوع A-scan بمتوسط حسابي. بعد تصوير كلتا العينين، استبدل العدسة اللاصقة بهلام عيني، وضع الفأر في قفص استشفاء دافئ.

لتحليل الصور المكتسبة باستخدام برنامج التصوير النمطي للتجزئة الآلية، قم أولاً بتصحيح القطاعات المقابلة للغشاء المحدد الداخلي والطبقة الضفيرية الداخلية يدويًا لتمثيل حدود طبقات الشبكية الداخلية. ثم تحقق من أن طبقتي الألياف العصبية للشبكية والخلايا العقدية تقعان ضمن حدود طبقة الشبكية الداخلية، وأنهما لا تتداخلان. يؤدي التحصين تحت الجلد ببتيدات AQP4 التي تحتوي على مستضدات الخلايا التائية الممرضة إلى استحثاث استجابات تكاثرية قوية للخلايا التائية في العقد الليمفاوية المصرّفة لدى الفئران التي تعاني من نقص AQP4 مقارنة باستجابات الخلايا التائية في النوع البري.

تُظهر تحليلات قياس التدفق الخلوي للتعبير الفردي عن V beta أن الخلايا التائية المتخصصة في ببتيدات AQP4 التي تحتوي على إبيطوبات تائية ممرضة تستخدم مجموعات متنوعة وفريدة من مستقبلات الخلايا التائية (TCR)، وتُظهر تكاثراً مفرطاً انتقائياً، مما يشير إلى أن الاستجابات التائية الممرضة لهذه المحددات يتم تنظيمها عادةً عن طريق الانتقاء السلبي الصدري. وبعد حوالي ستة إلى تسعة أيام من حقن الخلايا التائية المستقطبة، ظهرت على جميع الفئران المستلمة تقريباً علامات سريرية لمرض مناعي ذاتي في الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك ارتخاء الذيل وشلل الأطراف الخلفية. وقد أدت الخلايا التائية المتخصصة في AQP4 والمستقطبة نحو Th17 إلى إحداث مرض سريري أكثر شدة مقارنة بالخلايا التائية المتخصصة في AQP4 والمستقطبة نحو Th1.

على سبيل المثال، أصيب هذا الفأر بشلل كامل في الأطراف الخلفية بعد إعطائه خلايا T النوعية لـ AQP4 ببتيد والمستقطبة نحو Th17. كما يرتبط المرض السريري الناجم عن خلايا Th17 النوعية لـ AQP4 ببتيد بارتشاح الخلايا أحادية النواة في برنشيمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا، بالإضافة إلى التهاب العصب البصري، وهو ما يتجلى بوضوح في تورم وزيادة سمك الطبقة الشبكية الداخلية التي تعود إلى حالتها الأساسية مع تعافي الفئران من المرض. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحفيز ومراقبة المناعة الذاتية التي تستهدف AQP4، مما سيتيح إجراء المزيد من الدراسات لفهم كيفية مشاركة خلايا T في مرض التهاب النخاع والعصب البصري.