بروتوكول لتجميع المرحلة الصلبة من أوليغوميرس من الحمض النووي الريبي تحتوي على 2'- O -thiofenylmethyl تعديل وتوصيف عن طريق التعميم ديكرويسم

الهدف العام من هذا التقرير هو توضيح إجراء الحصول على قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي عن طريق تخليق الطور الصلب. سيتم تصنيع Dodecamers من الحمض النووي الريبي كنماذج وسيتم أيضا إثبات تنقيتها وتوصيفها. من خلال مكوناته المرئية ، سيوسع هذا المنشور نطاق المنهجيات والتسهيلات المستخدمة للباحثين في مختلف المجالات.

إن توفير المساعدة البصرية ، جنبا إلى جنب مع القليل من البروتوكول سيمكن الباحثين من استخدام هذه التقنيات. تتمثل إحدى ميزات هذه التقنية في ملاءمتها لمجموعة واسعة من التعديلات. نظرا لأن تطبيقات اليوم أصبحت أكثر تطلبا ، فمن المهم أن يكون لديك بروتوكول قياسي.

تشهد كيمياء الفوسفوراميديت عودة إلى الظهور بسبب متانة الطريقة وقدرتها على الحصول على قليل النوكليوتيدات للتطبيقات العلاجية. في حين أن شراء قليل النوكليوتيدات أمر جذاب ، فإن السعر وتوافرة التعديلات يحول الاهتمام نحو إعداد هذه القلة في المنزل ، مما يجعل هذا الإجراء ذا أهمية قصوى. لبدء هذا الإجراء ، قم بوزن كل فوسفوراميديت في زجاجات كهرمانية مجففة بالفرن سعة 10 مليلتر وقم بتغطية كل زجاجة بحاجز مثقب مسبقا بإبرة قياس 20.

ضع الزجاجات مباشرة تحت الفراغ باستخدام مجفف يحتوي على عامل تجفيف. بعد ملء المجفف بالأرجون الجاف ، قم بإزالة كل زجاجة وأضف الأسيتونيتريل اللامائي على الفور قبل تثبيته على مركب الببتيد ذو المراحل الصلبة. بعد ذلك ، قم بإزالة الحاجز من كل زجاجة ، وضعه على المركب عبر وظيفة تغيير الزجاجة.

لإعداد توليف الطور الصلب، حدد أيقونة البرنامج. حدد اسم المركب ، وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، قم بإنشاء توليف جديد عن طريق تحديد ملف وترتيب توليف جديد. بعد ذلك، استخدم نافذة المطالبة لإدخال تاريخ التشغيل والعميل ومعرف التشغيل.حدد الأداة واسم التسلسل والتسلسل.

ضمن علامة التبويب الدورة، قم بتعيين الطريقة التي تم إنشاؤها مسبقا. بعد ذلك ، اختر دليل الإجراء النهائي ، الذي يترك قليل النوكليوتيد مرتبطا براتنج CPG. حدد DMT Off.

احفظ الملف عن طريق تحديد ملف وحفظ باسم.ثم أدخل اسما للتجربة وانقر فوق حفظ. بعد ذلك ، أرسل الملف لبدء التوليف عن طريق تحديد طلب وإرسال طلب إلى Synthesizer. في نافذة المطالبة ، حدد موضع عمود وانقر فوق موافق. في نافذة Synthesizer ، حدد Trityl Monitor.

انقر فوق اختيار الوظيفة ، و Trityl Monitor كل خطوة عن طريق كتابة 1. ابدأ التوليف عن طريق تحديد Synthesizer و Prepare to Start. ضع الأعمدة ذات الطرف الثلاثة أولي المطلوب على المواضع الموضحة على الأداة.

ثم انقر فوق ابدأ و لا على الأداة. بمجرد اكتمال التوليف ، قم بإزالة العمود من الأداة وضعه في قارورة مستديرة القاع. جفف العمود تحت ضغط منخفض لمدة 0.5 ساعة تقريبا.

انقل الراتنج الأبيض من العمود إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.6 ملليلتر ، وأضف 0.5 مل من محلول الميثيل أمين المائي والأمونيا. قم بتأمين غطاء أنبوب الطرد المركزي باستخدام البارافيلم ، وقم بتسخين المحتويات إلى 60 درجة مئوية لمدة ساعة ونصف. ضع جسما ثقيلا أعلى الأنابيب لضمان الحفاظ على التركيز ثابتا.

بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي للعينة لفترة وجيزة لتدوير المحتويات. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد. قم بتبريد الأنبوب إلى 70 درجة مئوية عن طريق وضعه في حمام الإيثانول الثلجي الجاف لمدة خمس دقائق ، ثم ركز حتى يجف باستخدام مكثف فراغ سريع.

الآن ، أعد تعليق المواد الصلبة في 0.4 مل من محلول أمين ثلاثي هيدروفلوريد ، ثم قم بتأمين الغطاء بغشاء مختبر. سخني المحلول إلى 60 درجة مئوية لمدة ساعة ونصف. ضع جسما ثقيلا فوق الأنابيب لضمان التركيز الثابت.

بعد تبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 0.04 مل من محلول أسيتات الصوديوم متبوعا بالخلط اللطيف بطرف ماصة. أضف ملليلترا واحدا من الإيثانول وقم بتبريد المحلول إلى حوالي 70 درجة مئوية مع حمام الإيثانول الجاف لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 15 ، 000 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق.

استخدم ماصة لاستخراج المادة الطافية وتجفيف الحبيبات الناتجة تحت ضغط منخفض. بعد التجفيف ، قم بتعليق المخزن المؤقت الصلب والتحميل الذي تم الحصول عليه ، واخلطه حتى يصبح المحلول متجانسا. ثم قم بتحميل التعليق على جل بولي أكريلاميد معد مسبقا.

ضع تيارا عبر الجل حتى توجد علامة البروميثيمول الزرقاء بين نصف إلى ثلثي أسفل الجل. بعد إزالة الجل من الحامل ، انقل محتويات الجل من الزجاج إلى الغلاف البلاستيكي وضعها فوق طبقة رقيقة من الكروماتوغرافيا مغطاة بالسيليكا ، لتصور العصابات باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. استخدم علامة لتحديد الموضع الذي يوجد فيه الشريط العلوي ، وقم بقصه باستخدام شفرة حلاقة.

ضع الجل الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، واسحقه إلى قطع صغيرة باستخدام قضيب زجاجي. الآن ، قم بتعليق بقايا الهلام في محلول كلوريد الصوديوم المائي ، ورج المعلق عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، ثم جهاز الطرد المركزي بسرعة 3400 دورة في الدقيقة لمدة عشر دقائق.

لتحلية العينة باستخدام خرطوشة C18 ذات الطور العكسي ، اغسل الخرطوشة أولا بالأسيتونيتريل والماء وكلوريد الأمونيوم المائي ومحلول الحمض النووي الريبي ، تاركا وراءك بقايا الجل. بعد الغسيل بالماء ، قم بتصفية الحمض النووي الريبي من العمود باستخدام ثلاثة ملليلتر من محلول الميثانول المائي بنسبة 60٪ في ثلاثة أنابيب اختبار مختلفة. قم بتبريد الأنابيب إلى 70 درجة مئوية في حمام جليدي جاف لمدة خمس دقائق ، ثم ركز المحتويات على الجفاف باستخدام مكثف الفراغ السريع.

بعد تركيز المادة المشعثة تحت ضغط منخفض ، أعد إذابة البقايا في 0.3 مل من الماء الخالي من RNase. بعد تخفيف المحلول ، قم بإيداع ميكرولتر واحد على أداة الأشعة فوق البنفسجية لقياس طيف الأشعة فوق البنفسجية بين 200 و 450 نانومتر. لتحليل MALDI-TOF، اغسل أولا طرف ماصة C18 باستخدام 50٪ أسيتونيتريل.

قم بموازنة طرف الماصة مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. بعد ذلك، قم بتحميل طرف الماصة بمحلول يحتوي على 100 إلى 150 بيكومول من العينة. بعد غسل طرف الماصة بنسبة 0.1٪ TFA والماء ، قم بمسح العينة في محلول يحتوي على المصفوفة المطلوبة.

ضع 0.9 ميكرولتر من المحلول على لوحة MALDI واترك العينة تجف. لتحليل بنية الحمض النووي الريبي ، انقل العينة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى ميكروكوفيت ووضعها في مغير العينة لأداة ثنائية اللون الدائرية. افتح خزان النيتروجين لتوفير تدفق يحرك عوامة الهواء الموجودة على الجهاز إلى حوالي 40.

ثم قم بتشغيل المبرد. الآن ، قم بتشغيل الجهاز. افتح البرنامج بالنقر فوق أيقونة Spectrum Manager ، ثم افتح نافذة الاستحواذ بالنقر فوق قياس الطيف.

بعد تطهير الأداة بالنيتروجين ، احصل على أطياف ثنائية اللون الدائرية عن طريق تحديد القياس والمعلمات. ضمن علامة التبويب عام ، حدد 200-350 نانومتر للمسح ، و CD و HT للقنوات ، و 0.1 نانومتر لدرجة البيانات ، و 100 نانومتر في الدقيقة لسرعة المسح ، و نانومتر واحد لعرض النطاق الترددي ، وخمسة لعدد التراكمات. ضمن علامة التبويب وحدة الخلية، اختر 20 درجة مئوية.

ضمن علامة التبويب Control ، حدد Shutter يتم فتحه وإغلاقه تلقائيا. ضمن علامة التبويب المعلومات، أدخل اسم العينة والمشغل والتركيز والمذيب. ضمن علامة التبويب "البيانات" ، استعرض وصولا إلى المجلد المطلوب ، وانقر فوق "موافق". احصل على الأطياف بالنقر فوق قياس وقياس العينة.

أخيرا ، حدد مواضع الكوفيت في مبدل العينة من واحد إلى ستة ، وانقر فوق موافق. تم الحصول على الخيوط الأربعة للحمض النووي الريبي عن طريق تخليق الطور الصلب ، وبعد التنقية أنتج ما بين 300 و 700 نانومول من كل قليل النوكليوتيد. يتم عرض الكروماتوغرامات MALDI-TOF لقليل النوكليوتيدات هنا. لم يلاحظ أي اختلاف كبير في أطياف الأشعة فوق البنفسجية الطبيعية من مقارنة النطاق عند 260 نانومتر وقليل النوكليوتيدات الكنسية والمعدلة ، سواء كانت مقارنة العينات أحادية الشريطة أو الهياكل المزدوجة.

ومع ذلك ، لوحظت تغييرات طفيفة عند قياس أطياف ثنائية اللون الدائرية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت قياسات Tm للهياكل المزدوجة الثلاثة قيمة مميزة كانت مؤشرا على زعزعة الاستقرار الناجم عن دمج تعديلين أوليين أوثيو فينيل ميثيل على أحد الخيوط. من المهم أن تتذكر أن عائد تخليق الطور الصلب يعتمد على نقاء الكاشف.

سيكون للرطوبة تأثير سلبي على كل خطوة ، لأن كمية الماء الموجودة يجب أن تكون كاشفة في جميع الأوقات. تهدف المنهجية المبلغ عنها إلى أن تكون بمثابة مورد عام للعلماء. قد تختلف التقنية اعتمادا على التعديل المطلوب أو الأجهزة المتاحة أو قيود الوقت.

يمثل نوع الكيمياء المستخدمة هنا منهجية قوية للغاية تم استخدامها منذ الثمانينيات ، ولا تزال تستخدم بكثافة في البيئات الأكاديمية والصناعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء تخليق وتنقية وتوصيف قليل النوكليوتيدات المعدلة أو الكنسية الخاصة بك من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي. لا تنس أن العمل مع الكواشف اللازمة يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب ارتداء معدات الحماية مثل نظارات السلامة والقفازات ومعاطف المختبر في جميع الأوقات.

يجب التعامل مع جميع الكواشف بعناية ، وداخل غطاء الدخان عند الاقتضاء.