تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم النشاط السام للخلايا للخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) البشرية. يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة المرضى الذين يعانون من نقص الخلايا القاتلة الطبيعية، سواء كان نقصاً وظيفياً أو نقصاً كلاسيكياً. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية القائمة على قياس التدفق الخلوي في كونها حساسة وقابلة للتكرار، وأسرع من الطرق القياسية لتقييم وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية، مثل مقايسة تحرر الكروم المشع.

يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار العلاجات الجديدة التي تستهدف الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells)، بالإضافة إلى إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات والمتعمق لبيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية، وهو أمر لم يكن ممكناً تحقيقه سابقاً. ابدأ باستخدام الفصل بالتدرج الكثافي لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي، أو PBMC's، من عينات الدم الكامل وفقاً للبروتوكولات القياسية. إن استخدام PBMC's بدلاً من الخلايا القاتلة الطبيعية المنقاة يوفر فائدة كبيرة عند التعامل مع العينات السريرية.

قم بتخفيف الخلايا المعزولة لتصل إلى تركيز 5 × 10⁶ خلية لكل مليلتر في وسط غذائي كامل، ثم اجمع خلايا K562 المستهدفة فوراً عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق 5 × 10⁵ من خلايا 562 في 500 µL من وسط غذائي جديد مضاف إليه 1% FBS. بعد ذلك، قم بوسم الخلايا المستهدفة باستخدام 500 µL من محلول عمل CFSE، واخلط محلول الخلايا برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة من ثلاث إلى خمس مرات.

بعد 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع الحماية من الضوء، قم بإيقاف تفاعل الوسم بإضافة 10 ملليلتر من الوسط الكامل لمدة 10 دقائق في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة حضانة إيقاف التفاعل، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق كتلة الخلايا المستهدفة الموسومة في ملليلتر واحد من الوسط الكامل لغرض العد. بعد ذلك، خفف الخلايا لتصل إلى تركيز 1 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر من الوسط الكامل الطازج، وضع الخلايا المستهدفة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون.

لضمان نجاح المقايسة، يجب تقليل إجهاد الخلايا المستهدفة إلى أدنى حد واختبار الخلايا المؤثرة في أقرب وقت ممكن بعد جمعها. وفي غضون 30 دقيقة من وسم الخلايا المستهدفة، يتم وسم طبق زراعة أنسجة معالج ذو قاع على شكل حرف U يحتوي على 96 بئرًا وفقًا للجدول. بعد ذلك، أضف 100 µL من الوسط الكامل إلى الآبار ذات النسبة بين الخلايا المؤثرة والمستهدفة 25 إلى 1، و 12.5 إلى 1، و 6.25 إلى 1، والآبار التي تحتوي على الخلايا المستهدفة فقط، والآبار التي تحتوي على الخلايا المؤثرة فقط.

أضف 100 µL من الخلايا المؤثرة (effector cells) إلى آبار التحكم في السمية الخلوية، وإلى الآبار ذات النسبة 50 إلى 1 و 25 إلى 1 من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا الهدف. ثم ابدأ ببير النسبة 25 إلى 1 من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا الهدف، وانقل 100 µL من الخلايا إلى البئر الذي يليه في تركيز نسبة الخلايا الأدنى للبيرين التاليين، مع تخطي الآبار التي تحتوي على الخلايا الهدف فقط، مع الخلط جيداً بين كل عملية نقل للخلايا، ثم أضف آخر 100 µL من الخلايا إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا المؤثرة فقط. أضف 100 µL من محلول عمل 2X 0.2% Tween إلى آبار التحكم الإيجابي لموت خلايا K562 التي تحتوي على Tween فقط.

أضف 30 µL من المحلول العامل في القارورة الثانية إلى آبار الضابط الموجب لسمية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell cytotoxicity). بعد ذلك، أضف 1 × 10⁵ من الخلايا المستهدفة K562 لكل مليلتر في 100 µL من الوسط الكامل إلى جميع الآبار باستثناء الآبار المخصصة للخلايا المؤثرة فقط. بمجرد الانتهاء من توزيع جميع الخلايا، قم بمزج جميع الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات.

قم بترسيب الخلايا عن طريق عملية طرد مركزي قصيرة، ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة أربع ساعات. وفي نهاية فترة التحضين، ضع الطبق على الثلج أو على منصة تبريد، وأضف 50 µL من صبغة الخلايا الميتة المُحضرة حديثاً إلى كل بئر. بعد ذلك، اخلط جميع الآبار برفق وقم بتحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.

يكشف تحليل قياس التدفق الخلوي لصبغة CSFE وصبغة الخلايا الميتة بعد أربع ساعات من الزرع البارد، كما تم توضيحه للتو، أن الخلايا في الآبار التي تحتوي على الخلايا المستهدفة فقط تعاني من موت خلوي بنسبة 15% أو أقل. ولا يتم اكتشاف أي إشارة لـ CSFE في الآبار التي تحتوي على الخلايا المؤثرة فقط، مع ملاحظة موت خلوي بنسبة أقل من خمسة بالمائة في هذه الآبار. بينما تكون نسبة موت الخلايا في الآبار التي يتم فيها قتل الخلايا المستهدفة بوساطة Tween عادةً أكثر من 85%. أما في المرضى الذين يعانون من خلل في وظيفة خلايا NK، فيُلاحظ انخفاض في نشاط القتل في معظم أو جميع النسب المختبرة مقارنة بالأفراد الأصحاء، مما يدل على أن خلايا NK لدى هؤلاء المرضى تظهر انخفاضاً تفاضلياً في السمية الخلوية يرتبط بانخفاض نسبة الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ست ساعات ونصف، بما في ذلك ساعتان من التحضير والزرع، وأربع ساعات من الحضانة، و 30 دقيقة من عملية الاستحواذ. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير الخلايا المستهدفة والخلايا المؤثرة بالتوازي لتقليل وقت التأخير بين تحضير الخلايا وبدء الحضانة المشتركة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس النشاط السام للخلايا لـ NK البشرية ضد الخلايا المستهدفة الموصومة بالفلورسنت عن طريق قياس التدفق الخلوي.