Name: تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: تعلم تقييم نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية باستخدام تحليل التدفق الخلوي السريع والحساس. تُستخدم هذه الطريقة لتشخيص نقص الخلايا القاتلة الطبيعية وتقييم العلاجات المستهدفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر نارسيسو جيل، مركز إيمونوجينيتيكس، وجامعة كاليفورنيا لمساعدتها مع إعداد مخطوطة.

<ol><li>Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+NK+cell+responses+in+HIV+infection%3A+I.+NK+cell+receptor+genes+as+determinants+of+HIV+resistance+and+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS.</a> J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Topham, N. J., Hewitt, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+cytotoxicity%3A+how+do+they+pull+the+trigger%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?</a> Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).</li>
<li>Warren, H. S., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NK cells and apoptosis.</a> Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).</li>
<li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li>
<li>Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+mechanism+of+natural+killer+%28NK%29+degranulation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity.</a> J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+natural+killer+cell+function+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Determination of natural killer cell function by flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
<li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), e89357(2014).</li>
<li>Oppenheim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyco-engineered+anti-EGFR+mAb+elicits+ADCC+by+NK+cells+from+colorectal+cancer+patients+irrespective+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy.</a> Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).</li>
<li>West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cytotoxic+reactivity+of+human+lymphocytes+against+a+myeloid+cell+line%3A+characterization+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells.</a> J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).</li>
<li>Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li>
<li>Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometric+assay+for+quantitation+and+multiparametric+characterization+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).</li>
<li>Carotta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NK+Cells+for+Anticancer+Immunotherapy%3A+Clinical+and+Preclinical+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches.</a> Front Immunol. 7, 152(2016).</li>
<li>Mandal, A., Viswanathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells%3A+In+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Stem+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells: In health and disease.</a> Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).</li>
<li>Rezvani, K., Rouce, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Application+of+Natural+Killer+Cell+Immunotherapy+for+the+Treatment+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer.</a> Front Immunol. 6, 578(2015).</li>
<li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li>
<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

الكتاب يعلن أي تعارض للمصالح المالية.

الأسلوب الموصوفة هنا يوفر بديلاً واضحة وفعالة من حيث التكلفة للمقايسة الإفراج عن الجمهورية التشيكية التقليدية 51لتقييم نشاط ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا. هذا الأسلوب هو حساس واستنساخه، وأقل استهلاكاً للوقت من الأساليب القياسية السابقة، مثل اللجنة السويسرية للطعون، ويمكن استخدامها على حد سواء سريرية وبحوث التطبيقات.
بينما يعمل المقايسة مع مجموع ببمكس والمخصب ناغورني كاراباخ الخلايا، خيار استخدام ببمكس دون الحاجة إلى تنقية السكان خلية فائدة كبيرة عند التعامل مع كميات صغيرة م...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية مجموعة فرعية متطورة من الإنسان الفطرية لمفاوية المشاركة حاسمة في القضاء على الخلايا المصابة فيروسي وتحول الخلايا الأخرى المسببة للأمراض التهديدات 1،2. ناغورني كاراباخ خلية حبيبات الحال البيت البروتينات السامة للخلايا، مثل بيرفورين وجرانزيميس. عند التنشيط، ناغورني كاراباخ الخلايا تشكل تفاعل معقد مع أهدافها المعروفة باسم المشبك المناعية، حيث يتم الإفراج عن هذه الجزيئات عن محلياً، مما أدى إلى تحلل الخلية الهدف المباشر والمبرمج، إلى جانب الإفراج عن سيتوكين وتشيموكيني وفي نهاية المطاف في استحثاث التهابات الدولة 1،،من34.
ناغورني كاراباخ خلية التنشيط ينطوي على سلسلة معقدة من تفعيل والمثبطة التفاعلات بين ناغورني كاراباخ الخلايا مستقبلات ويغاندس أعرب على سطح الخلايا المستهدفة، وتشكيل نظام محكم تنظيم. واحدة من أهم درس آليات تفعيل الخلية ناغورني كاراباخ هو "الذات المفقودة". في الواقع، عدم الكشف عن فئة أنا الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC)، أو جزيئات مستضد (هلا) الكريات البيض البشرية، على المصابين أو تحول الخلايا المشغلات ناغورني كاراباخ خلية سيتوتوكسيسيتي. الورم والخلايا المصابة بالفيروسات عموما downregulate الخلية هذه المستضدات هربا من الحصانة T الخلية بوساطة، وبذلك أصبحت ناغورني كاراباخ الابتدائي الأهداف 1،،من34.
يتم تصنيف تقييم الدالة cell ناغورني كاراباخ أساسا إلى تحبب أو سيتوتوكسيسيتي فحوصات. ومع ذلك، فحوصات تحبب، مثل تدفق سيتوميتريك الكشف عن علامة تحبب المرتبطة CD107a، فقط إرشادية ناغورني كاراباخ خلية التنشيط وليس من وظيفتها في نهاية المطاف، قتل مباشرة من الخلايا الهدف 5،6،،من78. ومن ثم، اجتذب هذا القيد المحققين لفحوصات سيتوتوكسيسيتي كبديل أكثر دلالة وأكثر مباشرة.
منذ فترة طويلة "المعيار الذهبي" لتقييم الخلية بوساطة نشاط السامة للخلايا من خلايا تي وناغورني كاراباخ هو فحص الإصدار الكروم (CRA). CRA ينطوي على تسمية الخلايا المستهدفة مع 51Cr إشعاعيا وتفرخ لهم المشاركة مع خلايا المستجيب. هذا التحليل غارق في مبدأ أن تحلل الخلية يؤدي إلى الإفراج عن البروتين زمنياً 51Cr في المادة طافية، الذي يمكن أن يقاس بالعد غاما. هذا الفحص، بينما فعالة، وإشكالية بالنسبة لمجموعة متنوعة من الأسباب: ارتفاع تكاليف المواد ومعالجة والتخلص من المشعة 51Cr وعفوية الإفراج عن 51Cr وتوحيد صعبة--مما يجعل من غير العملي تماما 9،10.
منذ ذلك الحين وضعت عددا من الاختبارات غير المشعة، التي تشمل العلامات الفلورية والإفراج عن إنزيم، وحتى الإضاءة الحيوية، كبدائل لطعنة 11،12،،من1314. يصف لنا هنا تدفق الخلوي طريقة لقياس ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا نشاط في الخلايا الهدف K562 بسيطة وحساسة، واستنساخه. خلايا K562 هي خط خلية اريثروليوكيميك بشرية مع انخفاض التعبير عن فئة هلا أنا والتعبير المتزايد من يغاندس لمستقبلات أكتيفاتوري في ناغورني كاراباخ، مما يجعلهم عرضه بشكل خاص إلى ناغورني كاراباخ الخلية بوساطة سيتوتوكسيسيتي 15. في هذا التحليل، K562 الخلايا المسماة مسبقاً مع كاربوكسيفلوريسسين اسيتات سوكسينيميديل إستر (CFSE) ومثقف شارك في نسب مختلفة مع أما خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو تنقيته ناغورني كاراباخ الخلايا 1. كفسي هو صبغة فلورسنت مستقرة وملزمة البروتين يسمح تمييز الخلايا المستهدفة من المستجيب ناغورني كاراباخ الخلايا 16،17. بعد الحضانة المشتركة، وصمة عار حمض النووي، على وجه التحديد تتخلل غشاء الخلايا الميتة، يستخدم لتحديد الخلايا الهدف قتل (انظر الجدول للمواد). ثم تكتسب العينات في سيتوميتير تدفق لتحديد النسبة المئوية للميت (أي، وصمة عار +) كفسي + الخلايا المستهدفة.
يمكن استخدام هذا الفحص كفحص تشخيصي روتيني monogenic العيوب التي تؤثر في حجرة خلية ناغورني كاراباخ، التي يوجد منها حوالي 30 العيوب المعروفة يسبب عوز خلية ناغورني كاراباخ الوظيفية أو الكلاسيكية، وليمفوهيستيوسيتوسيس هيموفاجوسيتيك الابتدائي أو الثانوي. كما أنها مفيدة للتحقيق في نشاط الخلية ناغورني كاراباخ في المرضى مع القوباء المتكررة، وشديدة العدوى الفيروسية، لتقييم إعادة تشكيل المناعة بعد زرع الخلايا المكونة للدم أو وظيفة immunomodulatory العلاج 18،،من1920، ومجموعة كبيرة من تطبيقات البحوث الأساسية.

<table><tbody><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x ، بدون Ca2 + و Mg2 +) Corning</td> <td>(Cellgro)</td> <td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td> <td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة</td><td>أوميغا Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>حل مخزون بسعر 10,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R & D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>المجففة بالتجميد من 0.2 & م محلول مفلتر في الأسيتونيتريل و TFA مع BSA كبروتين ناقل. إعادة التكوين مع 500 ul في 100 & mu ؛ جم / مل في حمض الخليك المعقم 100 ملي مولار يحتوي على ما لا يقل عن 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار (2.1x10E6 وحدة دولية / مل)</td></tr> <tr><td>خلايا K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>خط الخلايا السرطانية &nbsp ؛</td></tr><tr><td>قوارير ثقافة الخلايا T-75</td><td>مجموعة تكاثر الخلايا Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td> <td>C34554</td><td>إعادة تكوين قارورة I مع 18 ul DMSO لإعداد محلول مخزون 5 ملم. لا تجمد/تذوب.</td></tr><tr>يتم توفير حل <td>الأسهم Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>في 5 & mu ؛ M في 1 مل DMSO. قد يخضع محلول DMSO لدورات متعددة من التجميد والذوبان دون تدهور الكاشف.</td></tr><tr><td>أنابيب جمع الدم من الصوديوم / الهيبارين الليثيوم BD</td><td></td><td>02-687-95</td><td></td></tr> لوحة <tr><td>U-bottom 96 بئر</td><td>ماصات كورنينج</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>مصلية</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>البوليسترين أنابيب مستديرة القاع (5 مل)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنبوب مخروطي بولي بروبيلين</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>كاشف خزان</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>كوكتيل تخصيب الخلايا الطبيعية البشرية</td><td>تقنيات الخلايا الجذعية (RosetteSep)</td> <td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

ضمن نظام المناعة الفطرية، لمفاوية المستجيب المعروفة باسم خلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية تلعب دوراً أساسيا في الدفاع المضيف ضد الخلايا الشاذة، وعلى وجه الخصوص القضاء على الأورام وفيروسي إصابة الخلايا. حوالي 30 من عيوب monogenic المعروفة، جنبا إلى جنب مع مجموعة كبيرة من الحالات المرضية الأخرى، يسبب نقص الخلية ناغورني كاراباخ الوظيفية أو الكلاسيكية، يظهر في انخفاض أو غياب النشاط السامة للخلايا. وتاريخيا، كانت قد أجرت التحقيق سيتوتوكسيسيتي مع أساليب المشعة، ومرهقة ومكلفة ويحتمل أن تكون خطرة. توضح هذه المقالة المطبقة سريرياً، تبسيط تدفق الخلوي طريقة لقياس نشاط ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا. في هذا التحليل، خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو المنقي الاستعدادات خلية ناغورني كاراباخ المحتضنة شارك في نسب مختلفة مع خط خلية ورم المستهدف من المعروف أن حساسة إلى ناغورني كاراباخ بوساطة الخلايا سيتوتوكسيسيتي (نككك). الخلايا المستهدفة المسماة مسبقاً مع صبغة فلورسنت للسماح بالتمييز ضدهم من خلايا المستجيب (ناغورني كاراباخ الخلايا). بعد فترة الحضانة، يتم تحديد الخلايا الهدف قتل بوصمة حمض النووي، الذي يتخلل الخلايا الميتة على وجه التحديد. هذا الأسلوب هو قابلة للتشخيص وتطبيقات البحوث سواء، بفضل قدرات متعددة المعلمة التدفق الخلوي، ميزة إضافية يحتمل أن يتيح إجراء تحليل أعمق من ناغورني كاراباخ خلية النمط الظاهري ووظيفة.

قبل إعداد المقايسة، المستحسن جداً أن يتم تقييم محتوى الخلية ناغورني كاراباخ في السكان المستجيب للاختيار. ويبين الشكل 1 تلطيخ CD56 نموذجية قبل (أزرق فاتح) وبعد تخصيب خلية ناغورني كاراباخ (أحمر). ناغورني كاراباخ الخلايا تتألف يصل إلى 15% ببمكس وينبغي أن يكون على الأقل 80 ٪ نقية بعد تخصيب اليورانيوم.
تحليل تدفق سيتوميتريك في هذا التحليل ينطوي على الكشف عن معلمتين: كفسي، يمكن اكتشافها في نفس القناة فيتك...

ويرد هنا تدفق الخلوي طريقة لتحديد الكمية نشاط السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية.

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم النشاط السام للخلايا للخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) البشرية. يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة المرضى الذين يعانون من نقص الخلايا القاتلة الطبيعية، سواء كان نقصاً وظيفياً أو نقصاً كلاسيكياً. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية القائمة على قياس التدفق الخلوي في كونها حساسة وقابلة للتكرار، وأسرع من الطرق القياسية لتقييم وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية، مثل مقايسة تحرر الكروم المشع.يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار العلاجات الجديدة التي تستهدف الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells)، بالإضافة إلى إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات والمتعمق لبيولوجيا الخلايا القاتلة الطبيعية، وهو أمر لم يكن ممكناً تحقيقه سابقاً. ابدأ باستخدام الفصل بالتدرج الكثافي لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي، أو PBMC's، من عينات الدم الكامل وفقاً للبروتوكولات القياسية. إن استخدام PBMC's بدلاً من الخلايا القاتلة الطبيعية المنقاة يوفر فائدة كبيرة عند التعامل مع العينات السريرية.قم بتخفيف الخلايا المعزولة لتصل إلى تركيز 5 × 10⁶ خلية لكل مليلتر في وسط غذائي كامل، ثم اجمع خلايا K562 المستهدفة فوراً عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق 5 × 10⁵ من خلايا 562 في 500 µL من وسط غذائي جديد مضاف إليه 1% FBS. بعد ذلك، قم بوسم الخلايا المستهدفة باستخدام 500 µL من محلول عمل CFSE، واخلط محلول الخلايا برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة من ثلاث إلى خمس مرات.بعد 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع الحماية من الضوء، قم بإيقاف تفاعل الوسم بإضافة 10 ملليلتر من الوسط الكامل لمدة 10 دقائق في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة حضانة إيقاف التفاعل، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق كتلة الخلايا المستهدفة الموسومة في ملليلتر واحد من الوسط الكامل لغرض العد. بعد ذلك، خفف الخلايا لتصل إلى تركيز 1 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر من الوسط الكامل الطازج، وضع الخلايا المستهدفة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون.لضمان نجاح المقايسة، يجب تقليل إجهاد الخلايا المستهدفة إلى أدنى حد واختبار الخلايا المؤثرة في أقرب وقت ممكن بعد جمعها. وفي غضون 30 دقيقة من وسم الخلايا المستهدفة، يتم وسم طبق زراعة أنسجة معالج ذو قاع على شكل حرف U يحتوي على 96 بئرًا وفقًا للجدول. بعد ذلك، أضف 100 µL من الوسط الكامل إلى الآبار ذات النسبة بين الخلايا المؤثرة والمستهدفة 25 إلى 1، و 12.5 إلى 1، و 6.25 إلى 1، والآبار التي تحتوي على الخلايا المستهدفة فقط، والآبار التي تحتوي على الخلايا المؤثرة فقط.أضف 100 µL من الخلايا المؤثرة (effector cells) إلى آبار التحكم في السمية الخلوية، وإلى الآبار ذات النسبة 50 إلى 1 و 25 إلى 1 من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا الهدف. ثم ابدأ ببير النسبة 25 إلى 1 من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا الهدف، وانقل 100 µL من الخلايا إلى البئر الذي يليه في تركيز نسبة الخلايا الأدنى للبيرين التاليين، مع تخطي الآبار التي تحتوي على الخلايا الهدف فقط، مع الخلط جيداً بين كل عملية نقل للخلايا، ثم أضف آخر 100 µL من الخلايا إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا المؤثرة فقط. أضف 100 µL من محلول عمل 2X 0.2% Tween إلى آبار التحكم الإيجابي لموت خلايا K562 التي تحتوي على Tween فقط.أضف 30 µL من المحلول العامل في القارورة الثانية إلى آبار الضابط الموجب لسمية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell cytotoxicity). بعد ذلك، أضف 1 × 10⁵ من الخلايا المستهدفة K562 لكل مليلتر في 100 µL من الوسط الكامل إلى جميع الآبار باستثناء الآبار المخصصة للخلايا المؤثرة فقط. بمجرد الانتهاء من توزيع جميع الخلايا، قم بمزج جميع الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات.قم بترسيب الخلايا عن طريق عملية طرد مركزي قصيرة، ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة أربع ساعات. وفي نهاية فترة التحضين، ضع الطبق على الثلج أو على منصة تبريد، وأضف 50 µL من صبغة الخلايا الميتة المُحضرة حديثاً إلى كل بئر. بعد ذلك، اخلط جميع الآبار برفق وقم بتحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.يكشف تحليل قياس التدفق الخلوي لصبغة CSFE وصبغة الخلايا الميتة بعد أربع ساعات من الزرع البارد، كما تم توضيحه للتو، أن الخلايا في الآبار التي تحتوي على الخلايا المستهدفة فقط تعاني من موت خلوي بنسبة 15% أو أقل. ولا يتم اكتشاف أي إشارة لـ CSFE في الآبار التي تحتوي على الخلايا المؤثرة فقط، مع ملاحظة موت خلوي بنسبة أقل من خمسة بالمائة في هذه الآبار. بينما تكون نسبة موت الخلايا في الآبار التي يتم فيها قتل الخلايا المستهدفة بوساطة Tween عادةً أكثر من 85%. أما في المرضى الذين يعانون من خلل في وظيفة خلايا NK، فيُلاحظ انخفاض في نشاط القتل في معظم أو جميع النسب المختبرة مقارنة بالأفراد الأصحاء، مما يدل على أن خلايا NK لدى هؤلاء المرضى تظهر انخفاضاً تفاضلياً في السمية الخلوية يرتبط بانخفاض نسبة الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ست ساعات ونصف، بما في ذلك ساعتان من التحضير والزرع، وأربع ساعات من الحضانة، و 30 دقيقة من عملية الاستحواذ. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير الخلايا المستهدفة والخلايا المؤثرة بالتوازي لتقليل وقت التأخير بين تحضير الخلايا وبدء الحضانة المشتركة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس النشاط السام للخلايا لـ NK البشرية ضد الخلايا المستهدفة الموصومة بالفلورسنت عن طريق قياس التدفق الخلوي.

a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نحن هنا تصف طريقة لتوسيع بكفاءة وتنقية أعداد كبيرة من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية وتقييم وظائفها.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

يوضح هذا الفيديو النشاط اللايتي للخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا المستهدفة الملطخة بالفلورسنت. تتيح هذه الطريقة قياس السمية الخلوية التي تسببها الخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق تلطيخ الخلايا الميتة واستخدام مقياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المستهدفة الحية والميتة.

تحضير عينة فحص السمية الخلوية بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية لتحليل قياس التدفق الخلوي

يصف هذا البروتوكول مقايسة السمية الخلوية الحساسة القائمة على الخلية. من خلال تعداد الانخفاض في تواتر الخلايا التائية CD4 + المستهدفة الحية في وجود عدد متزايد من الخلايا التائية المستجيبة CD8 + ، يسمح هذا الاختبار بالتقييم المباشر للنشاط المحلل للخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد.

مقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا لقياس النشاط السام للخلايا

وصفت وهناك طريقة بسيطة وموثوق بها هنا لتحليل مجموعة من وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية مثل تحبب، خلوى والإنتاج chemokine ضمن مختلف مجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية.

الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

يصف هذا العمل سير عمل متقدما لتحديد دقيق وسريع لعدد خلايا NK (القاتل الطبيعي) وسمية الخلايا الطبيعية في عينات الدم البشري.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

التهرب من القاتل الطبيعي (NK) القضاء على الخلايا بوساطة الخلايا السرطانية مهم لبدء السرطان والتقدم. هنا، نقدم بروتوكولين غير قائمين على النشاط الإشعاعي لتقييم السمية الخلوية بوساطة NK تجاه خلايا الورم الكبدي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم بروتوكول ثالث لتحليل ترحيل خلية NK.

قياس السمية الخلوية بوساطة الخلية القاتلة الطبيعية والهجرة في سياق خلايا الورم الكبدي

ويرد هنا وصف بروتوكول لدراسة الأحداث التي تحركها FcγRIIIa من قبل الأجسام المضادة العلاجية في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. تسمح منصة التحفيز الاصطناعي هذه باستجواب وظائف التأثير المصبي مثل إزالة التجريح ، وإنتاج chemokine / cytokine ، ومسارات الإشارات بوساطة أجزاء FcγRIIIa و Fc من الأجسام المضادة المشاركة في الربط.

تقييم أحداث الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية مدفوعة بمشاركة FcγRIIIa في وجود أجسام مضادة علاجية

يصف هذا البروتوكول طريقة خالية من الملصقات للتحليل السريع لخلية واحدة لعدد الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ونشاطها باستخدام تقنية تصوير الظل الخالية من العدسة. تحدد هذه الطريقة التغيرات المورفولوجية في خلايا NK الفردية عن طريق التحليل المحوسب لأنماط حيودها.

منصة تصوير خالية من العدسات قابلة للنشر الميداني لتحليل سريع خال من الملصقات لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية

يوفر هذا البروتوكول سير عمل موحد في المختبر لقياس متسق للسمية الخلوية الطبيعية التي تعتمد على مستقبلات المستضدات الكيميرية والمعتمدة على الأجسام المضادة لخلايا القاتل الطبيعية البشرية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس تدفق الخلية.

قياس سمية الخلايا غير السرطانية التي تعزز بواسطة مستقبلات المستضدات الكيميرية والأجسام المضادة العلاجية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس خلوية التدفق

Tregs والمكثفات قوية من الجهاز المناعي. هناك عدم وجود علامات سطح فريدة لتعريف بهم ، وبالتالي ، تعريفات Tregs وظيفية في المقام الأول. نحن هنا تصف...

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

تعلم تقييم نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية باستخدام تحليل التدفق الخلوي السريع والحساس. تُستخدم هذه الطريقة لتشخيص نقص الخلايا القاتلة الطبيعية وتقييم العلاجات المستهدفة.

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

استكشف المزيد من الفيديوهات