تحليل دقيق والفائق للنمو البكتيري

الهدف العام من هذه التجربة هو تحليل نمو البكتيريا بدقة بطريقة عالية الإنتاجية. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن اختبار وسائط متعددة أو سلالات متنوعة في وقت واحد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الأنظمة ومجالات علم الأحياء الدقيقة مثل عوامل تحديد نمو الخلايا.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح للباحثين بتقييم المعلمات العالمية بدقة لمعدل النمو الأقصى والكثافة السكانية القصوى في منحنيات نمو الخلايا البكتيرية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على e. نمو القولونية ، يمكن أيضا تطبيقه على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى مثل فحص النمو وفحص البكتيريا البيئية.

للبدء ، ضع خمسة أنابيب زجاجية معقمة مع سدادات مطاطية من السيليكون وماصات وسلالات الهدف على مقعد نظيف. قم بتعريض فم الأنبوب الزجاجي لموقد بنسن قبل فتح سدادة مطاط السيليكون. قم بتعريض سدادة مطاط السيليكون للهب بعد فتح الأنبوب ثم ضع الغطاء برفق مرة أخرى على الأنبوب الزجاجي.

بعد ذلك، استخدم الماصة الإلكترونية والماصة المصلية التي تستخدم لمرة واحدة لإضافة خمسة ملليلتر من M63 إلى أحد الأنابيب الزجاجية و4.5 ملليلتر من M63 إلى الأنابيب الأربعة الأخرى. استخدم طرف p200 لاختيار مستعمرة وتلقيحها في الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من M63. دوامة الأنبوب لعمل تعليق.

بعد ذلك ، قم بتخفيف المحلول 10 أضعاف عن طريق نقل 0.5 مل من هذا المحلول إلى أحد الأنابيب الأربعة التي تحتوي على 4.5 مل من M63. كرر هذه العملية للأنابيب المتبقية. بعد تعقيم أفواه الأنابيب الزجاجية وسدادات مطاط السيليكون ، قم بتغطية الأنابيب بالسدادات.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب الخمسة في حاضنة اهتزاز دافئة مسبقا عند 37 درجة مئوية ورجها 200 دورة في الدقيقة. احتضن الثقافة بين عشية وضحاها أو لمدة 10 إلى 30 ساعة. بعد الحضانة ، أضف 1,000 ميكرولتر من M63 إلى كوفيت يمكن التخلص منه مع p1000.

ضع الكوفيت القابل للتصرف في مقياس الطيف الضوئي. ابدأ البرنامج بطول موجي ثابت يبلغ 600 نانومتر وقم بقياس الفراغ. انقل الأنابيب الزجاجية الخمسة من حاضنة الاهتزاز إلى المقعد النظيف.

تخلص من M63 من الكوفيت القابل للتصرف وأضف 1,000 ميكرولتر من الثقافة إلى نفس الكوفيت الذي يمكن التخلص منه مع p1000. ثم قم بقياس التعكر البصري لثقافة الخلايا. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من محلول الجلسرين المعقم بنسبة 60٪ و 750 ميكرولترا من مزرعة الخلايا المختارة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مليلتر واخلطه عن طريق سحب العينات.

ضع الأنابيب الدقيقة التسعة المتبقية في حامل الأنبوب الدقيق وقم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخليط المحضر على كل أنبوب. قم بتخزين المرق في ديب فريزر على حرارة 80 درجة مئوية. لإعداد قارئ اللوحة الدقيقة ، افتح البرنامج أولا ، وافتح البروتوكولات في مدير المهام واختر إنشاء جديد.

ثم حدد البروتوكول القياسي. افتح الإجراء واضبط الإعدادات. افتح درجة الحرارة المحددة وحدد الحاضنة.

ثم اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والتدرج إلى صفر درجة مئوية. تحقق من التسخين المسبق قبل متابعة الخطوة التالية. افتح حركية البداية واضبط وقت التشغيل لمدة 24 أو 48 دقيقة ، ثم اضبط الفاصل الزمني 30 دقيقة أو ساعة واحدة.

افتح الاهتزاز واضبط وضع الاهتزاز على أنه خطي. تحقق من الاهتزاز المستمر واضبط التردد على 567 نسخة في الدقيقة. بعد ذلك ، افتح القراءة ، وتحقق من الامتصاص ، ونقطة النهاية / الحركية وأحادية اللون.

اضبط الطول الموجي على 600. أخيرا ، انقر فوق التحقق من الصحة للتأكد من صحة الإجراء. وانقر فوق حفظ لحفظه كبرنامج جديد للاستخدام في المستقبل.

لتسجيل النمو في الوقت الفعلي ، أضف ما يقرب من 25 مل من M63 إلى خزان كاشف معقم. ثم أضف 900 ميكرولتر من M63 إلى الأنابيب الدقيقة استعدادا لعمل التخفيفات التسلسلية. بعد ذلك ، أضف 900 ميكرولتر من M63 إلى مخزون الجلسرين المذاب والدوامة.

انقل 100 ميكرولتر من التخفيف 10 أضعاف إلى أنبوب دقيق آخر يحتوي على 900 ميكرولتر من M63 والدوامة. كرر هذه الخطوة حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من التخفيفات. الآن ، املأ الآبار على حافة صفيحة دقيقة معقمة 96 بئر مسطحة القاع ب 200 ميكرولتر من M63 ، باستخدام ماصة ثماني القنوات.

قم بتحميل 200 ميكرولتر من كل عينة مخففة في آبار الصفيحة الدقيقة وفقا للجدول المرجعي. لتجنب طبقات التخصيص بسبب التسخين وكفاءة البذر ، لا تستخدم أبدا الآبار الموجودة على حافة الصفيحة الدقيقة لعيناتك وقم بتحميل نفس العينة في آبار متعددة في مواقع متنوعة على الصفيحة الدقيقة. ضع الصفيحة الدقيقة 96 جيدا على قارئ الألواح.

افتح القراءة الآن ومدير المهام واختر البرنامج. انقر فوق موافق لبدء القياس. أخيرا ، احفظ التسجيل كملف تجريبي جديد لتحليل البيانات.

يظهر هنا مثال على جدول مرجعي تم إنشاؤه قبل إجراء التجربة. تم رسم رسم تخطيطي للوحة 96 بئر كجدول ثمانية × 12 للإشارة إلى مواضع عينات الاستزراع الملقحة على صفيحة البئر 96. ويحسب معدل النمو بتطبيق المعادلة على جميع أزواج القيم المتتالية OD600.

تم حساب المتوسط والانحراف المعياري لخمسة معدلات نمو متتالية لتقدير معدل النمو الأقصى. يشار إلى معدلات نمو ما مجموعه 60 مزرعة خلوية على أنها خريطة الحرارة المعروضة. يشير التدهور من الأبيض إلى الأحمر إلى معدلات النمو من المنخفض إلى الأعلى.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون بضع دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح وبالترتيب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات وتحميلها على الصفيحة الدقيقة للحصول على قياسات دقيقة للغاية لنمو البكتيريا بطريقة إنتاجية عالية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عمل جدول مرجعي قبل إجراء التجربة لتجنب المزارع الخلوية منخفضة الكثافة والتأكد من أن الخلايا تبدأ في النمو في غضون 24 ساعة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل أتمتة التلاعب التجريبي والتحليل الحسابي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل عوامل تحديد الانتشار السكاني والديناميكيات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات بيولوجيا الأنظمة وعلم الأحياء الدقيقة. لاستكشاف المبادئ الأساسية في نمو الخلايا وتحسين تركيبات وسائط الاستزراع.