تحليل دقيق والفائق للنمو البكتيري

الهدف العام من هذه التجربة هو تحليل النمو البكتيري بدقة وبطريقة عالية الإنتاجية. وباستخدام هذا الإجراء، يمكن اختبار أوساط زراعية متعددة أو سلالات متنوعة في آن واحد. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات بيولوجيا الأنظمة وعلم الأحياء الدقيقة، مثل تحديد العوامل المؤثرة في نمو الخلايا.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح للباحثين تقييم المعايير العامة لمعدل النمو الأقصى وكثافة المجتمع الميكروبي القصوى بدقة في منحنيات نمو الخلايا البكتيرية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول نمو e. Coli، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات مجهرية أخرى، مثل مقايسات النمو وفحص البكتيريا البيئية.

للبدء، ضع خمسة أنابيب زجاجية معقمة ذات سدادات من مطاط السيليكون، وماصات، والسلالات المستهدفة على طاولة عمل نظيفة. عرض فوهة الأنبوب الزجاجي للهب موقد بنزن قبل فتح سدادة مطاط السيليكون. عرض سدادة مطاط السيليكون للهب بعد فتح الأنبوب، ثم ضع الغطاء برفق مرة أخرى على الأنبوب الزجاجي.

بعد ذلك، استخدم الماصة الإلكترونية والماصة السيرولوجية disposable لإضافة 5 mL من M63 إلى أحد الأنابيب الزجاجية و4.5 mL من M63 إلى الأنابيب الأربعة الأخرى. استخدم رأس الماصة p200 لالتقاط مستعمرة وتلقيحها في الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على 5 mL من M63. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز Vortex لعمل معلق.

بعد ذلك، قم بتخفيف المحلول بمقدار 10 أضعاف عن طريق نقل 0.5 milliliters من هذا المحلول إلى أحد الأنابيب الأربعة التي تحتوي على 4.5 milliliters من M63. كرر هذه العملية للأنابيب المتبقية. بعد تعقيم فوهات الأنابيب الزجاجية وسدادات المطاط السيليكوني، أغلق الأنابيب باستخدام السدادات.

بعد ذلك، ضع الأنابيب الخمسة في حاضنة هزازة مُسخنة مسبقاً عند 37 degree celsius مع الرج بسرعة 200 rpm. يتم تحضين المزرعة طوال الليل أو لمدة تتراوح بين 10 إلى 30 ساعة. وبعد انتهاء التحضين، أضف 1, 000 microliters من M63 إلى كوفيت (cuvette) مخصصة للاستخدام مرة واحدة باستخدام p1000.

ضع الكيوفيت (cuvette) المخصصة للاستخدام مرة واحدة في جهاز spectrophotometer. ابدأ البرنامج عند طول موجي ثابت قدره 600 nanometers وقم بقياس العينة الضابطة (blank). انقل الأنابيب الزجاجية الخمسة من الحاضنة الهزازة إلى طاولة العمل النظيفة (clean bench).

تخلص من M63 من الكيوفيت المخصص للاستخدام لمرة واحدة، ثم أضف 1,000 µL من المزرعة إلى الكيوفيت نفسه باستخدام p1000. بعد ذلك، قم بقياس العكارة الضوئية للمزرعة الخلوية. تالياً، أضف 250 µL من محلول glycerol بتركيز 60% معقم و750 µL من المزرعة الخلوية المختارة إلى أنبوب ميكروي سعة 1.5 mL واخلطهما عن طريق الماصة.

ضع الأنابيب الدقيقة التسعة المتبقية في حامل الأنابيب الدقيقة ووزع 100 µL من الخليط المُحضّر في كل أنبوب. خزن المخزونات في المجمد العميق عند 80 °C. لضبط جهاز قارئ الأطباق الدقيقة، افتح البرنامج أولاً، ثم افتح البروتوكولات في مدير المهام واختر إنشاء جديد.

بعد ذلك، اختر البروتوكول القياسي. افتح الإجراء وقم بتعديل الإعدادات. افتح قائمة ضبط درجة الحرارة واختر تشغيل الحاضنة.

بعد ذلك، اضبط درجة الحرارة على 37 °C والتدرج الحراري على zero °C. تحقق من التسخين المسبق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. افتح خيار "بدء الحركية" (start kinetic) واضبط وقت التشغيل على 24 أو 48 دقيقة، ثم اضبط الفاصل الزمني على 30 دقيقة أو ساعة واحدة.

افتح إعدادات الرج (shake) واضبط وضع الرج على أنه خطي (linear). قم بتفعيل الرج المستمر واضبط التردد عند 567 cpm. بعد ذلك، افتح إعدادات القراءة (read)، وتحقق من الامتصاصية (absorbance)، ونقطة النهاية/الحركية (endpoint/kinetic)، وأجهزة أحادية اللون (monochromators).

اضبط الطول الموجي على 600. وأخيرًا، انقر فوق "validate" للتأكيد على صحة الإجراء. ثم انقر فوق "save" لحفظه كبرنامج جديد للاستخدام المستقبلي.

لتسجيل النمو في الوقت الحقيقي، أضف حوالي 25 milliliters من M63 إلى خزان كواشف معقم. بعد ذلك، أضف 900 microliters من M63 إلى الأنابيب الدقيقة استعداداً لعمل تخفيفات تسلسلية. ثم أضف 900 microliters من M63 إلى مخزون الجلسرول المذاب وقم بالمزج باستخدام جهاز vortex.

انقل 100 µl من التخفيف بمقدار 10 أضعاف إلى أنبوب ميكروي آخر يحتوي على 900 µl من M63 وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتيكس. كرر هذه الخطوة حتى يتم تحقيق عدد التخفيفات المطلوب. الآن، املأ الآبار الموجودة على حافة لوحة ميكروية ذات قاع مسطح ومعقمة تحتوي على 96 بئراً بـ 200 µl من M63، باستخدام ماصة ثمانية القنوات.

قم بتحميل 200 µL من كل عينة مخففة في آبار الطبق الدقيق وفقاً لجدول المرجع. ولتجنب تكون طبقات توزيعية نتيجة التسخين ولضمان كفاءة الاستزراع، لا تستخدم أبداً الآبار الموجودة على حافة الطبق الدقيق لعيناتك، وقم بتحميل العينة نفسها في عدة آبار في مواقع مختلفة على الطبق الدقيق. ضع الطبق الدقيق المكون من 96 بئراً على قارئ الأطباق.

افتح برنامج read now ومدير المهام (task manager) ثم اختر البرنامج المطلوب. انقر على موافق لبدء القياس. وأخيراً، احفظ التسجيل كملف تجريبي جديد لتحليل البيانات.

يظهر هنا مثال لجدول مرجعي تم إعداده قبل إجراء التجربة. وقد رُسم مخطط توضيحي لصفيحة ذات 96 بئراً على شكل جدول مكون من ثمانية أعمدة و12 صفاً لتحديد مواقع عينات المزارع الملقحة في الصفيحة. ويتم حساب معدل النمو بتطبيق المعادلة على جميع أزواج القيم المتتالية لـ OD600.

تم حساب المتوسط والانحراف المعياري لخمسة معدلات نمو متتالية لتقدير أقصى معدل نمو. وتظهر معدلات النمو لإجمالي 60 مستنبتًا خلويًا كما هو موضح في الخريطة الحرارية المعروضة. ويشير التدرج من اللون الأبيض إلى الأحمر إلى معدلات النمو من المنخفضة إلى العالية.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون بضع دقائق إذا تم تطبيقها بشكل صحيح وبالترتيب المناسب. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتحميل العينات في الطبق الدقيق (microplate) لإجراء قياسات دقيقة للغاية لنمو البكتيريا بطريقة عالية الإنتاجية. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إعداد جدول مرجعي قبل إجراء التجربة لتجنب المزارع الخلوية ذات الكثافة المنخفضة ولضمان بدء نمو الخلايا في غضون 24 ساعة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل أتمتة المعالجة التجريبية والتحليل الحاسوبي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد العوامل المؤثرة في انتشار المجموعات السكانية وديناميكياتها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات بيولوجيا الأنظمة وعلم الأحياء الدقيقة بعد تطويرها، وذلك لاستكشاف المبادئ الأساسية في نمو الخلايا وتحسين تركيبات أوساط الزرع.