خطوات الإعداد لقياس مفاعليه في الماوس الشرايين الشبكية السابقين فيفو

يتمثل الهدف العام من طريقة تحضير الشبكية هذه في استخدام المجهر الفيديوكي لقياس استجابة الشرايين الشبكية لدى الفأر. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تنظيم تدفق الدم في الشبكية، وقد تساهم في تعميق فهمنا للفيزيولوجيا المرضية لمختلف أمراض العين. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية الجديدة في أنها تسمح بقياس استجابة الأوعية الدموية الشبكية بدقة بصرية عالية جداً.

وفي الوقت نفسه، لا تتطلب هذه الطريقة الكثير من المعدات المتطورة. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً لصعوبة تحديد موقع الشريان العيني وفروعه. سأقوم بشرح هذا الإجراء بالتعاون مع جنيا كوشك زاده ووائل عمران، وهما طالبان في مرحلة الدراسات العليا من مختبري.

استعد للإجراءات التجريبية عن طريق تجهيز الأدوات المطلوبة. بعد ذلك، استخدم مقصًا فولاذيًا لقص جمجمة الفأر سهميًا إلى نصفين، واستخدم مقص العيون لإزالة الجلد والدماغ. استخدم مقص العيون لإزالة عظم الجمجمة حتى يتبقى عظم الحجاج فقط، ثم انقل الحجاج إلى طبق تشريح يحتوي على محلول Krebs-Henseleit المنظم المبرد بالثلج تحت مجهر جراحي.

اقطع العظم الحجاجي باستخدام مقصات العين، واستخدم ملاقط دقيقة من النوع الرابع ومقصات فاناس (Vannas) الزنبركية المخصصة للطلاب لإزالة مقلة العين والأنسجة الحجاجية برفق. وباستخدام ملاقط دقيقة من النوع الخامس ومقصات فاناس لفتح المحفظة، قم بإزالة الغدة الهارديرية (Harderian gland)، والنسيج الضام، والعضلات خارج العين بعناية، مع الحرص على عدم إتلاف الفرع الرئيسي للشريان العيني. استخدم خيوط نايلون 10-0 لربط الفروع الحجاجية في الطرف القريب من الفرع الرئيسي للشرايين العينية، واستخدم الملاقط الدقيقة من النوع الرابع لنقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على 70% ethanol.

من المهم جداً ربط جميع الفروع الحجاجية للشريان العيني لتجنب التسرب أثناء التجربة. وبعد مرور 10 ثوانٍ، أعد مقلة العين إلى طبق التشريح. سيظهر القرنية باللون المائل للبياض نتيجة التعرض للإيثانول.

استبدل المحلول المنظم بمحلول Krebs جديد، واستخدم المجهر وإبرة بقياس ثلاثة (three gauge) لثقب القرنية المحيطية. استخدم مقصات Vannas capsulotomy لتشريح القرنية وقص أنسجة القزحية برفق. ثم ضع طرفاً حاداً واحداً من مقصات Vannas capsulotomy بين المشيمية والشبكية وقم بقص المشيمية والصلبة.

لتثبيت الشبكية في غرفة تروية مصنعة خصيصاً، استخدم أولاً حامل إبر لدفع طرف ماصة دقيقة زجاجية ذات سن بقطر 100 micrometer داخل الأنبوب السيليكوني للغرفة. بعد ذلك، قم بتوصيل المحقنة بالطرف الآخر من الأنبوب لشطف سن الماصة الدقيقة من أي شوائب. املأ غرفة التروية بمحلول Krebs المنظم البارد وضع الغرفة تحت مجهر ستيريو.

ضع منصة بلاستيكية شفافة بها تجويف بعمق 1.8 millimeter فوق سلكين فولاذيين بقطر 1.6 millimeter داخل غرفة التروية، ثم ضع حلقة من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق المنصة. استخدم ملعقة لنقل الشبكية مع العصب البصري بينما لا يزال الشريان العيني متصلاً بها إلى المنصة، ثم قم بإزالة الطرف المخيط من الشريان العيني. ضع حلقتين من خيوط الجراحة من نوع 10-0 Nylon على الماصة الدقيقة، وثبت الشريان بالماصة الدقيقة باستخدام الخيوط.

استخدم ملقطاً دقيق السن لوضع الشبكية على المنصة الشفافة، واستخدم زوجاً ثانياً من الملاقط دقيقة السن لتمزيق محفظة العدسة الأمامية برفق. اسحب العدسة للخارج واستخدم مقصات مجهرية لإزالة محفظة العدسة بالكامل والجسم الزجاجي. بعد ذلك، قم بإجراء أربعة شقوق شعاعية في الشبكية على مسافة تعادل نصف المسافة من الجزء المسطح (pars plana) إلى العصب البصري، ثم ضع الحلقة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق الشبكية لتثبيتها على المنصة.

لتجهيز الشرايين الصغيرة في الشبكية للتحليل، انقل غرفة التروية تحت مجهر ضوئي واختر العدسة الشيئية الغاطسة المائية 100X. قم بتوصيل الأنابيب بفتحات الدخول والخروج لمضخة دورانية وقم بتدوير محلول Krebs buffer في الغرفة عند درجة حرارة 37 °C، مؤكسجاً بـ 95% oxygen ومكربناً بـ 5% carbon dioxide. قم بتوصيل أنبوب السيليكون المزود بالماصّة الدقيقة بخرطوم خزان سيليكون عبر صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات، واملأ الخزان بمحلول Krebs buffer إلى ارتفاع يعادل 50 millimeters of Mercury.

باستخدام العدسات الشيئية، قم بضبط التركيز يدويًا على سطح الشبكية للبحث عن الأوعية الدموية أو خلايا الدم الحمراء. عند العثور على وعاء دموي، قم بتركيز الرؤية عليه وافتح صمام الإيقاف ثلاثي الاتجاهات. يجب أن يزداد قطر الوعاء فورًا وتظهر خلايا الدم الحمراء.

بعد فترة اتزان مدتها 30 دقيقة، ستطور الشريينات نغمات ذاتية ضعيفة مع انخفاض في قطر التجويف بنسبة أقل من 10%. أضف كاشف تقييد الشبكية للفئران إلى محلول الحمام وتأكد من حيوية الوعاء الدموي. بعد ذلك، قم بتشغيل المضخة لغسل المادة المناهضة من الحمام وأضف محلول كريبس المنظم الطازج إلى الغرفة.

في هذه التجربة النموذجية، أحدث U46619، وهو محاكي للثرومبوكسان، استجابات قابضة للأوعية تعتمد على التركيز في الشريينات الشبكية لفئران C57Bl/6J من النوع البري، حيث أدى ذلك إلى انخفاض في القطر اللمعي بنسبة 50% تقريبًا من حالة الراحة عند تركيز 1 × 10⁻⁶ مولار. وفي الشريينات التي تم تضييقها مسبقًا باستخدام المادة المحفزة، أدى الإعطاء التراكمي للأسيتيل كولين إلى زيادة في القطر اللمعي تعتمد على التركيز لتصل إلى 25% تقريبًا من القطر المضيق مسبقًا عند تركيز أسيتيل كولين 1 × 10⁻⁵ مولار، مما يشير إلى سلامة بطانة الأوعية الدموية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 90 إلى 120 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذه الإجراءات، تذكر ربط جميع الفروع الشريانية خلف المقلة لغمر العين في الإيثانول قبل فتح مقلة العين لتجنب التواء الشريان العيني، وأخيرًا التحقق من عدم وجود انسداد في رؤوس الماصات الزجاجية الدقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير شبكية الماوس للقياس الشرياني باستخدام المجهر الفيديو في المختبر.