تحويل الزرد الفتاكة Penetrance متحولة الهيكل العظمى بذرية اختبار

الهدف العام لاستراتيجية التكاثر هذه هو التلاعب باختراق الطفرة لأعلى أو لأسفل. تتيح طريقة التربية الانتقائية هذه فهما أكثر اكتمالا للأنماط الظاهرية الطافرة. من خلال توليد سلالات متحولة عالية ومنخفضة الاختراق ، يمكن فهم سلسلة النمط الظاهري الكاملة للطفرة.

معظم قشور أسماك الزرد حيث تكون الطفرات قاتلة متنحية ، لذلك تموت الطفرات متماثلة اللواقح قبل أن يتم تربيتها مباشرة. لذلك ، نستخدم استراتيجية التربية الانتقائية الكلاسيكية لاختبار النسل ، والتي نوضحها هنا. كان لدينا لأول مرة عنصر لهذه الطريقة عند محاولة تسجيل الفاصل الزمني لنمو الخلايا العظمية خارج الرحم.

بشكل محبط ، ظهرت خلايا عظمية إضافية فيه بشكل متكرر ، لذلك شرعنا في تغيير المخترقات الطافرة عن طريق التكاثر الانتقائي. على الرغم من أننا ننفذ هذه الطريقة على مقياس سمك الزرد بخط متحور ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأنماط الظاهرية الطافرة الأخرى لأسماك الزرد وعلى الأرجح الكائنات الحية الأخرى. بعد تحضير مخزون أسماك الزرد الأولية غير المحدد وفقا لبروتوكول النص ، قم بإجراء التنميط الجيني KASP على النحو التالي.

ضع نسيج ذيل الزرد في 50 ميكرولترا من محلول التحلل في آبار صفيحة 96 بئر. أضف 10 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز ك لكل بئر وهضم عينات الأنسجة في جهاز تدوير حراري عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى خمس ساعات. تليها خطوة تعطيل لمدة 20 دقيقة و 94 درجة مئوية.

قم بتبريد منتج التحلل بعد الهضم. استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد كمية الحمض النووي الجيني. بعد ذلك ، باستخدام الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية ، قم بتخفيف القالب الجيني بحيث يحتوي كل تفاعل على ما يقرب من 20 إلى 30 نانوجراما.

أضف 0.14 ميكرولتر من مزيج KASP التمهيدي وخمسة ميكرولترات من مزيج KASP الرئيسي لكل عينة على الثلج ، في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر واخلطه جيدا. ثم ، جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع المحتويات في الجزء السفلي من الأنبوب. ماصة خمسة ميكرولترات من محلول المزيج الرئيسي التمهيدي في آبار لوحة PCR بصرية 96 جيدا مناسبة لجهاز PCR في الوقت الفعلي المستخدم.

بعد ذلك ، قم بإدخال خمسة ميكرولترات من عينات قالب الحمض النووي المخففة في كل بئر وشفطها بماصة للخلط. ضع ختم فيلم شفاف بصريا فوق اللوحة ، مع التأكد من إغلاق الفيلم بالكامل على كل بئر. قم بالطرد المركزي للوحة لفترة وجيزة عند 600 × G لجمع المحتويات في الأسفل وإزالة الفقاعات من المزيج.

بعد إجراء تفاعل KASP الرئيسي ، اعرض مخطط التشتت الناتج عن كمبيوتر التحليل. ضع متغايرة الزيجوت التي تم تحديدها معا في نظام المياه الرئيسي. بعد أن يتعافى من مشبك الزعنفة ، قم بإعداد التهجين الزوجي ، واستخدم الفواصل لضمان مزامنة الأجنة.

اجمع الأجنة ، واحتفظ بأزواج الوالدين معزولة في أقفاص التكاثر. راقب البالغين المعزولين ، بحيث يمكن فصل الأسماك العدوانية أو تزويدها بالغطاء. لتربية الأجنة في اليوم الخامس أو السادس ، عندما يتم نفخ مثانة السباحة في 75٪ من القابض ، استخدم ماصة زجاجية لجمع البرية الظاهرية.

ضع الأنواع البرية المظهرية في الحضانة ، وسجل الآباء الذين أنتجوها. بعد تخدير اليرقات التي لا تنفخ مثاناتها وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة باستور زجاجية عريضة التجويف لجمع في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. قم بإزالة ماء الجنين من كل أنبوب واستبدله بمليلتر واحد من 2٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS.

هز الأنابيب لمدة ساعة واحدة لإصلاح. تتبع الأنابيب بانتظام خلال هذه الخطوات وجميع خطوات التأرجح اللاحقة للتأكد من عدم وجود يرقات عالقة على الجانب أو تكتل في قاع الأنبوب. استخدم ماصة زجاجية لإزالة المثبت من الأنابيب.

ثم أضف ملليلتر واحد من 50٪ من الإيثانول. هز العينات لمدة 10 دقائق إضافية. قم بإعداد محلول تلطيخ طازج عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من 0.5٪ أليزارين أحمر لكل مليلتر واحد من مزيج Alcian.

قم بإزالة الإيثانول بنسبة 50٪ ، وأضف ملليلترا واحدا من محلول التلوين إلى كل أنبوب. ثم هز الأنابيب بين عشية وضحاها. في غضون أيام قليلة بعد تبييض الأجنة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسجيل ذرية متحولة ملطخة للمخترقين.

في هذا المثال ، نسجل أي تكرار لعظم الموضوع. بالنسبة للجيل القادم ، اختر اثنين من الاختراقات العالية وعائلتين منخفضتي الاختراق. امنح كل زوج من الوالدين معرف مخزون فرعي ، على سبيل المثال ، العائلة 4.01 ، 02 ، وما إلى ذلك.

من المفيد أيضا الإشارة إلى رقم الجيل الفطري أو الفطري على جميع التسميات. منزل أزواج الوالدين على النظام الرئيسي مع العديد من الأسماك المصاحبة للجنس المختلط. يمكن أن تكون الأسماك المصاحبة أي خط من أسماك الزرد ذات السمات المميزة الواضحة الدائمة ، مثل التصبغ المتغير أو بنية الزعنفة.

قم بتسمية الخزانات التي تحتوي على يرقات الأخوة من النوع البري من عائلات مختارة مع المخترقات من الأشقاء المتحولين وقم بتربية الأسماك إلى مرحلة البلوغ كالمعتاد. يجب أن يؤدي التكاثر الانتقائي عن طريق اختبار النسل إلى تحول في المخترقات الإجمالية إلى الأسفل والأعلى في غضون أجيال قليلة. في هذه الأمثلة ، تنطبق على mef2ca b1086 متحولة ، تم اختيار مخترقات عالية أو منخفضة لعظم الموضوع بين الأشعة الأوبركال والأشعة المتفرعة في الطفرات المتماثلة اللواقح القاتلة.

في إجراء الصب الناجح ، يجب التعرف على مجموعات النوع من العينات المقابلة لنوع الجين بواسطة برنامج الكمبيوتر ويجب أن تكون NTCs موجودة بالقرب من أصل المؤامرة بعد إجراء دورات كافية. كما هو موضح هنا ، فإن البقعة الزرقاء الناجحة من ألسيان ، وصبغة أليزارين الحمراء ستحتوي على عناصر عظام وغضاريف ملطخة بالحياة غير شفافة أو باهتة. يجب أن تظهر حدود عناصر الغضروف واضحة وسيتم تمييز التناقضات الفردية.

اللون الأزرق Alcian الذي يركز بشكل كبير واضحا من الأنسجة الأخرى مما يجعل التحليل مستحيلا. من المحتمل أن يؤدي تنفيذ هذه التقنية من صيانة خط أسماك الزرد إلى تغيير المخترقات في غضون أجيال قليلة. باتباع هذا الإجراء ، قد تؤدي الطرق الأخرى مثل التهجين NC2 ودراسات التصوير بفاصل زمني إلى نتائج أكثر اتساقا.

نستخدم هذه التقنية لاستكشاف وراثة تباين النمط الظاهري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تربية السلالات الطافرة بشكل انتقائي لتغيير الاختراق ، حتى لو كانت الطفرة قاتلة.