تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقييم كل من الشيخوخة وإعادة البرمجة في الجسم الحي داخل العضلات الهيكلية عند حدوث إصابة في الأنسجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة أسئلة حاسمة في مجال الطب التجديدي، مثل كيفية تعزيز اللدونة الخلوية لتحفيز تجدد العضلات. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في توفير طريقة موثوقة للكشف عن الخلايا الهرمة وقياس كميتها في البيئة المحيطة.

لقد تم مؤخراً ربط شيخوخة الخلايا بعمليتي إصلاح الأنسجة وتجديدها. ومن المؤكد أن فهم الآليات التي تساهم من خلالها الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها سيكون له تأثير على الطب التجديدي. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما بحثنا في التأثير المحتمل لتلف الأنسجة على إعادة البرمجة في الجسم الحي في العضلات الهيكلية.

لبدء هذا الإجراء، قم بتثبيت شرائح عينات العضلات في 1%paraformaldehyde و0.2%glutaraldehyde في PBS لمدة أربع دقائق. بعد ذلك، اغسل الشرائح بـ PBS مرتين، ولمدة 10 دقائق في كل مرة. ثم اغسل الشرائح بـ PBS، pH 5.5 لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يتم تحضين المقاطع مع محلول X-gal في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. بعد ذلك، تُغسل الشرائح بمحلول PBS ثلاث مرات، لمدة 10 دقائق في كل مرة. ثم، يتم تثبيت الشرائح نهائياً باستخدام محلول PBS يحتوي على 1% paraformaldehyde لمدة 30 دقيقة.

أخيراً، اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد ذلك، قم بالصبغ المقابل بـ 0.2% eosin عن طريق غمر الشرائح في محلول eosin لمدة دقيقة واحدة. ثم اشطفها بالماء المقطر لفترة وجيزة.

قم بتثبيت الشرائح باستخدام وسط تثبيت مائي غير فلوري. ثم ثبّت الشرائح باستخدام محلول PBS يحتوي على 4% paraformaldehyde لمدة 10 دقائق. اغسلها بمحلول PBS مرتين، لمدة 10 دقائق في كل مرة.

بعد ذلك، أضف محلول النفاذية، ثم قم بالتحضين لمدة خمس دقائق. تلى ذلك غسل الشرائح بمحلول PBS مرتين، ولمدة خمس دقائق في كل مرة. وفي الغسلة الأخيرة، أضف 200 µL من محلول PBS، الذي يحتوي على 0.25%BSA، مباشرة على الشرائح لمدة خمس دقائق.

قم بتحضين الشرائح مع الجسم المضاد الأولي المضاد لـ Nanog بتركيز 1.25 micrograms per milliliter طوال الليل عند 4 degrees Celsius في محلول PBS يحتوي على 5%FBS. اغسل الشرائح بمحلول PBS مرتين، لمدة 10 minutes في كل مرة. في الغسلة الأخيرة، استخدم 200 microliters من محلول PBS الذي يحتوي على 0.25%BSA لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم تحضين الشرائح مع 100 µL من الأجسام المضادة الثانوية RAB-HRP من مجموعة أدوات جاهزة للاستخدام لمدة 45 دقيقة. ثم تُغسل الشرائح بمحلول PBS ثلاث مرات، ولمدة خمس دقائق في كل مرة لإزالة الأجسام المضادة الثانوية. بعد ذلك، يتم تخفيف DAB في محلول التلقيم المنظم (substrate buffer) المرفق مع مجموعة الأدوات الجاهزة للاستخدام.

قم بالرج بقوة باستخدام جهاز المرج (Vortex). أضف 100 µL من محلول DAB مباشرة على كل شريحة، ثم حضنها لمدة أقصاها 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإزالة محلول DAB عن طريق غسل الشرائح بالماء.

قم بصبغ الشرائح بالصبغة المضادة باستخدام محلول fast red لمدة دقيقتين. بعد ذلك، اغسل الشرائح بالماء مرة أخرى لفترة وجيزة. تلى ذلك تجفيفها باستخدام 95%ethanol لمدة خمس دقائق، ثم باستخدام 100%ethanol مرتين، ولمدة خمس دقائق في كل مرة.

بعد ذلك، قم بتثبيت الشرائح باستخدام وسط تثبيت سريع التصلب. افحص الشرائح تحت المجهر في وضع المجال المضيء عند تكبير 20x لتجنب الخلفية. في هذا الإجراء، قم بمسح الشرائح واختيار أفضل مقطعين من حيث الجودة في كل شريحة، مع مراعاة ترك أقصى مسافة ممكنة بينهما بناءً على سلامة الأنسجة، وجودة الصبغ، والصبغ المقابل.

قم بعدّ الخلايا الإيجابية لـ SA-Beta-Gal في هذين المقطعين واحسب القيمة المتوسطة. بعد ذلك، حدد رتبة حجم البكسل من خلال اختيار أصغر وأكبر الخلايا الإيجابية لـ SA-Beta-Gal يدويًا. في واجهة ImageJ، انقر فوق Analyze ثم Tools ثم ROI Manager ثم Analyze ثم Set Measurement.

بعد ذلك، اختر Area. استخدم أداة التحديد لإحاطة أصغر وأكبر خلية إيجابية لـ SA-Beta-Gal، ثم أضفها إلى ROI Manager بالضغط على Add. بعد ذلك، قم بقياس الأحجام باستخدام زر Measure، واحفظ القيم لاستخدامها لاحقاً.

بعد ذلك، قم بتعديل معامل العتبة لضمان تحديد جميع الخلايا الإيجابية المرئية. حوّل الصورة إلى التدرج الرمادي من خلال النقر على Image، ثم Type، ثم 8-bit. بعد ذلك، انتقل إلى Image، ثم Adjust، ثم Threshold.

حرك المؤشر الثاني حتى يتم تغطية جميع خلايا SA-Beta-Gal الإيجابية باللون الأحمر، ثم انقر على Apply. قم بتحليل الجسيمات بالنقر على Analyze، ثم Analyze Particles، متبوعة بـ Size وقم بتطبيق القيمة المحددة مسبقاً. أدخل Circularity، 0.00-1.00، وانقر على OK. سيظهر ملخص لجميع الجسيمات التي تم عدها في ROI Manager.

الآن، انقل جميع الجسيمات المحددة إلى الصورة الأصلية. قم بتعديل التحديد يدويًا لضمان دقة التحديد الكمي. أضف الخلايا الموجبة أو استبعد الخلايا الموجبة الكاذبة.

أخيراً، قم بقياس المساحة عن طريق تحديد المقطع باستخدام أداة الاختيار. انقر على ROI Manager، ثم Add، ثم Measure. وباستخدام المجهر، قم بعدّ الخلايا الإيجابية لـ Nanog في الحقل المضيء يدوياً عند تكبير 20x.

يظهر هنا تمثيل تخطيطي لتقييم إعادة البرمجة في الجسم الحي ومستوى الشيخخة بعد إصابة العضلات. وفيما يلي الصور التمثيلية لصبغ SA-Beta-Gal وNanog في المقاطع المجمدة للعضلات الهيكلية المتضررة. تُظهر هذه الصور صبغ SA-Beta-Gal، مع صبغ مضاد بالإيوسين، وصبغ Nanog، مع صبغ مضاد بالأحمر السريع.

تظهر العضلات غير المصابة في الأعلى، بينما تظهر العضلات المصابة في الأسفل. يوضح هذا الرسم البياني التحديد الكمي والارتباط بين الخلايا الموجبة لـ SA-Beta-Gal والخلايا الموجبة لـ Nanog في مقاطع متتالية بعد 10 أيام من الإصابة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إدراج ضابط سلبي دائمًا لضمان خصوصية الصبغ.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ جميع الطرق، مثل التألق المناعي واختيار علامات شيخوخة مختلفة، على جميع أنواع الخلايا للإجابة على أسئلة إضافية، مثل الهوية الخلوية للخلايا الهرمة. ومع كل تطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الشيخوخة، أو إصلاح الأنسجة وتجددها، لاستكشاف كيف يمكن للشيخوخة الخلوية أن تعزز اللدونة الخلوية لتسهيل إصلاح الأنسجة وتجددها في الثدييات. لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد كل من الخلايا الهرمة والخلايا المعاد برمجهتها في الجسم الحي.