تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

الهدف العام من التصوير متعدد الفوتون هو التقاط صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة في الوقت الفعلي لمجموعات الخلايا المهاجرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي ، مثل رسم خرائط مسارات الهجرة لمجموعات الخلايا المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الفحص المجهري متحد البؤر التقليدي هي أن الليزر متعدد الفوتون له اختراق أعمق للأنسجة وانخفاض السمية الضوئية.

هذا يزيد من قابلية الاستخدام في الأنسجة السميكة ويسمح بفترات أطول من الحصول على الصور. للإعداد لجمع الأجنة بين الساعة 3:00 و 9:00 مساء ، قم بتجميع خزانات التكاثر وتعبئتها بالتناضح العكسي ، أو ماء التناضح العكسي.

انقل ما يصل إلى ثلاث إناث وثلاثة ذكور إلى جوانب متقابلة من الخزان المقسم. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الحاجز بعد فترة وجيزة من تشغيل الأضواء في الحيدة. اسمح بالتزاوج دون إزعاج لمدة 20 دقيقة أو حتى يتم إنتاج أعداد كافية من الأجنة.

ستكون الأجنة في قاع خزان التكاثر. عند ملاحظة البيض ، ارفع الخزان الداخلي المشقوق مع الأسماك ، وضعه بسرعة في خزان خارجي نظيف وصلب مملوء بماء التناضح العكسي استخدم شاشة جمع البيض لجمع البيض من الخزان الخارجي ونقل البيض إلى أطباق بتري التي تحتوي على 30 مل من وسط الجنين 1X.

احتضان البيض الذي تم جمعه عند 28.5 درجة مئوية. بالنسبة للأجنة المعدلة وراثيا ، في 24 ساعة بعد الإخصاب أو HPF ، قم بإزالة البويضات الميتة وتقييم مرحلة نمو الأجنة. باستخدام الملقط ، قم بإزالة المشيمات من ثلاثة إلى أربعة أجنة تعبر عن GFP.

تحت مجهر ستيريو مضان تشريح مع مرشح إثارة قياسي من 460 إلى 490 نانومتر ، قم بفحص الأجنة الإيجابية ل GFP. انقل هذه الأجنة إلى طبق بتري منفصل يحتوي على 30 مل من وسط الجنين الطازج 1X. بعد 20 HPF ، ضع الأجنة الإيجابية GFP التي تم فحصها وإزالتها في محلول PTU بنسبة 0.003٪ لتثبيط التصبغ.

تجنب بدء العلاج في وقت مبكر لأنه يمكن أن يكون له آثار ضارة على القمة العصبية وتطور الظهارة العصبية. أضف 0.4 جرام من مسحوق LowMelt Agarose إلى 20 مل من وسط الجنين 1x. سخني الخليط لمدة دقيقة إلى دقيقتين أو حتى يصبح المحلول صافيا وتذوب جميع الجزيئات.

Aliquot ما يقرب من 1 مل من محلول Agarose في أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل للتخزين. لإعداد غرفة الحمام المفتوحة ، ضع كمية صغيرة من الشحوم ذات التفريغ العالي على قاعدة حجرة الحمام المفتوحة. ضع غطاء زجاجي دائري على القاعدة وقم بربط الجزء العلوي من حجرة الحمام المفتوحة على القاعدة حتى تصبح ضيقة.

ماصة ما يقرب من 500-700 ميكرولتر من محلول 2٪ Agarose في غرفة الحمام المفتوحة حتى تمتلئ القاعدة بحوالي 3/4 ثوان. انتظر 30 ثانية للسماح للأغاروز بالتبريد قليلا دون بلمرة كاملة ثم نقل جنين واحد إلى مركز القاعدة. تحت مجهر استريو فلوري ، استخدم طرف ماصة صغيرة سعة 10 ميكرولتر لتوجيه الجنين ووضعه بالقرب من قاع الاغاروز حتى لا يطفو بعيدا عند إضافة وسط الجنين.

تتمثل الخطوة الحاسمة في التأكد من وضع الجنين بشكل صحيح في Agarose. في هذه التجارب ، نقوم بتوجيه الجنين بشكل جانبي ولكن يمكن أيضا وضع الجنين للتركيز على المناطق الظهرية والبطنية. راقب الجنين وأعد وضعه حتى يتماسك الاغاروز.

ثم استخدم ماصة نقل لملء الغرفة المفتوحة المجمعة بالكامل بوسط جنين بفاصل زمني. بعد وضع الإعداد بأكمله على مسرح المجهر ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم هدف الخمس مرات لتحديد موقع الجنين. ثم ارفع المسرح يدويا إلى أعلى موضع واستخدم التركيز الدقيق لوضع الجنين في منتصف نطاق المجهر.

قم بخفض المرحلة يدويا وقم بتغيير هدف الخمس مرات إلى هدف الغمر في الماء لمدة 25 مرة. ارفع المسرح بعناية لإعادة الجنين إلى التركيز. في البرنامج ، انقر فوق وضع XYTZ للحصول على صور متعددة في الوقت المناسب أو فترات T في مستوى XY على عمق Z.استخدم عرض التألق أو المجال الساطع للعثور على عمق التركيز في منطقة الاهتمام التي ستحدد المكدس z.

بالنسبة لهذه التجارب ، فإن الحافة الجانبية للعين هي بداية المكدس z. عند التركيز هنا ، انقر في البرنامج فوق زر البدء. بعد التركيز لأسفل على خط منتصف الجنين ، وهو نهاية المكدس z ، انقر فوق زر النهاية.

تتمثل الخطوة الحاسمة في التأكد من أن الخطوة Z تشمل مجال الاهتمام. في حالتنا ، نريد التقاط عرض العين من الحواف الجانبية إلى الحواف الإنسية. انقر فوق القائمة لضبط وقت الاستحواذ وتردد التصوير.

من أجل التعافي الكافي من الفلور4 وبقاء الجنين ، اسمح بنسبة واحدة إلى ثلاثة على الأقل بين اكتساب z-stack عند تشغيل طاقة الليزر ووقت الاسترداد عند انقطاع طاقة الليزر. مع الوقت المناسب لاستعادة الأجنة ، اضبط الوقت بين المداخن z في النافذة المحددة. ثم اضبط المدة الزمنية الإجمالية للتجربة في النافذة المناسبة.

الآن ، قم بتشغيل إعداد الصورة الحية لإجراء تعديلات نهائية على إعدادات الليزر. اضبط أشرطة التمرير بالليزر والكسب والإزاحة داخل البرنامج لتحسين الصورة الفلورية. أيضا ، اضبط اتجاه الجنين حسب الحاجة اعتمادا على طول التجربة ، والنمو المتوقع للجنين ، وما إلى ذلك.

تأكد من بقاء منطقة الاهتمام داخل الإطار طوال مدة التجربة. أثناء الحصول على الفاصل الزمني ، قم بإيقاف تشغيل مصدر ضوء التألق ، وقم بتغطية المسرح بصندوق أمان الليزر المناسب للحماية من ضوء الخلفية ، ثم اضغط على ابدأ. قم بالوصول إلى غرفة الحمام المفتوحة من خلال الأبواب المنزلقة الموجودة على صندوق الأمان بالليزر لإعادة تعبئتها بوسط جنين الفاصل الزمني كل 8-12 ساعة.

بعد الحصول على التصوير ، افتح الملفات الموجودة في برنامج معالجة الصور ، وقم بتمييز سلسلة الصور الصحيحة. في البرنامج ، اختر قائمة العملية ، وانقر فوق 3D deconvolution وقم بتطبيقه لفك كل z-stack. قم باستيراد ملفات tif الفردية إلى برنامج معالجة الفيديو ، ثم حدد جميع ملفات tif واسحبها إلى محرر الفيديو.

اضبط طول كل صورة داخل الفيديو إلى 0.1 ثانية. أخيرا ، قم بتصدير الفيديو كملف mov أو mp4. ترى هنا من خلال التصوير الفلوري متعدد الفوتون أنماط هجرة خلايا القمة العصبية القحفية التي تؤدي إلى ظهور هياكل الوجه القحفية والجزء الأمامي من العين في خطوط سمك الزرد المعدلة وراثيا sox10: EGFP و foxd3: GFP.

تهاجر خلايا القمة العصبية الموجبة Sox 10 بين 12 و 30 HPF من حافة الأنبوب العصبي إلى منطقة الوجه القحفية. تهاجر الخلايا من الدماغ الوعائي والدماغ المتوسط ظهريا وبطنيا إلى العين النامية لملء الميسنسين حول العين. كما هو موضح هنا ، تشكل الخلايا الإيجابية sox10 عملية الأنف الأمامية.

تهاجر خلايا القمة العصبية من المعين الدماغي البطني وتؤدي إلى ظهور أقواس البلعوم. يظهر التصوير بفاصل زمني لخلايا القمة العصبية الإيجابية foxd3 بين 30 و 60 hpf أن هذه الخلايا هاجرت بين الكوب البصري والأديم الظاهر السطحي وعلى الرغم من أن الشق العيني المميز بالسهم واندمجت حول العدسة التي تميزت بالنجمة التي تشكل سدى القزحية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية من البداية إلى النهاية في أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار الأجنة التي تحتوي على كمية عالية من التألق. قد يكون إعداد البرنامج في البداية أمرا صعبا ولكن بمجرد تحديد المعلمات ، عادة ما تكون التغييرات الإضافية ضئيلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفحص المجهري متعدد الفوتون بفاصل زمني لتصوير الخلايا المهاجرة في الجنين.