إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو إنشاء مكتبة إدخال ترانسبوزون عالية الكثافة في بكتيريا Escherichia coli أو Shigella flexneri باستخدام الاقتران البكتيري. وتسمح هذه التقنية بإنشاء مئات الآلاف من الطفرات البكتيرية الفريدة من خلال الإدخال الجينومي العشوائي لترانسبوزون Tn10. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نقل البلازميد الحامل للترانسبوزون يتم عبر الاقتران البكتيري بدلاً من الطرق الأخرى الأقل كفاءة، مثل التثقيب الكهربائي.

بالإضافة إلى ذلك، يندمج ترانسبوزون Tn10 نفسه في الجينوم بانحياز أقل مقارنة بالترانسبوزونات الأخرى. باستخدام تقنية التعقيم، أضف 1 mL من مزرعة مبيتية للسلالة المانحة في أنبوب إبندورف معقم. يجب تمييز الأنبوب، على سبيل المثال، بالحرف D للإشارة إلى المانح (donor).

كرر العملية ذاتها مع السلالة المستقبلة عبر نقل 1 mL من المزرعة الليلية للسلالة المستقبلة إلى أنبوب Eppendorf معقم. وقم بتسميته بـ R، اختصاراً لـ recipient (المستقبلة) على سبيل المثال. ثم قم بطرد مركزي لكلا الأنبوبين لمدة دقيقة واحدة بسرعة 14,000 ×g في درجة حرارة الغرفة.

يمكن القيام بذلك باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي. وأثناء تشغيل جهاز الطرد المركزي، قم بتحضير المرشحات لعملية الاقتران. استخدم ملقطاً معقماً لوضع مرشح نيتروسليلوز على طبق agar LB مُصنف لا يحتوي على مضادات حيوية.

وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ورق لطخ معقم بدلاً من مرشح النيتروسليلوز. يتم وضع كل مرشح على طبق منفصل من أغار LB لتقليل احتمالية التلوث. تأكد من وضع كل مرشح على طبق أغار LB يحمل ملصق تعريف مناسب.

قم بتجهيز ثلاثة أطباق، يحتوي كل منها على مرشح؛ طبق للسلالة المانحة، وطبق للسلالة المستقبلة، وطبق للمكتبة. وبمجرد انتهاء عمل جهاز الطرد المركزي، قم بإزالة المزارع التي حُضنت طوال الليل.

قم بإزالة جميع أوساط النمو المحتوية على المضادات الحيوية من أنبوب eppendorf وتخلص منها. احرص على عدم زعزعة أو إزعاج كتلة الخلايا البكتيرية المترسبة، ومع ذلك حاول إزالة كافة أوساط النمو. تأكد من العمل بأسلوب معقم وتغيير الرؤوس بين كل عينة وأخرى.

أضف 110 µL من وسط LB الطازج الخالي من المضادات الحيوية إلى كل أنبوب Eppendorf، ثم اسحب السائل وادفعه بالمصّة لإعادة تعليق المزرعة. تأكد من العمل بطريقة معقمة. استمر في عملية السحب والدفع بالمصّة عدة مرات لضمان عدم بقاء أي تكتلات خلوية.

تُجرى هذه الخطوة لتركيز المزرعة البكتيرية وإزالة أي مضادات حيوية متبقية من المزرعة التي تم تحضيرها طوال الليل. باستخدام الماصة، ضع 50 µL من مزرعة المانح المركزة على المرشح المسمى Donor. أضف الـ 50 µL ببطء إلى المرشح على شكل قطرات.

كرر العملية ذاتها لسلالة المستقبل بإضافة 50 microliters من المزرعة المعاد تعليقها، حيث يتم وضع المزرعة المركزة المعاد تعليقها على مرشح المستقبل على شكل قطرات. ولكي يحدث الاقتران، تُضاف كل من سلالة المستقبل وسلالة المانح إلى ورقة المرشح نفسها لضمان وجود تلامس مادي وثيق بينهما. وللقيام بذلك، أضف 50 microliters من كل من سلالة المانح وسلالة المستقبل إلى المرشح نفسه في الطبق المسمى library.

ضع أطباق الآجار هذه التي تحتوي على المرشحات عند 37 درجة لمدة ست ساعات. وتحدث عملية الاقتران على مدار ست ساعات عند 37 درجة Celsius. وخلال عملية الاقتران، ينتقل بلازميد pJA1 إلى السلالة المستقبلة.

بعد عملية الاقتران، يتم فصل البكتيريا عن المرشح باستخدام جهاز الرج (vortexing) وتحفيزها باستخدام IPTG بتركيز 1 millimolar. يقوم IPTG بتحفيز إنزيم الترانسبوزاز (transposase)، ومن ثم يتم إدراج الترانسبوزون الذي يحتوي على جين مقاومة الكانامايسين (Kanamycin) بشكل عشوائي في جينوم السلالة المستقبلة. يتم زراعة البكتيريا على أطباق أغار LB تحتوي على الكانامايسين ومضاد حيوي آخر لاختيار السلالة المستقبلة التي تحتوي على الترانسبوزون.

سلالة المستقبل سالبة لـ Lambda pir، وبالتالي يتم فقدان بلازميد pJA1. بعد ست ساعات من النمو عند 37 درجة Celsius، تكتمل عملية الاقتران. قم بإزالة الأطباق التي تحتوي على المرشحات من الحاضنة.

استخدم ملقطاً معقماً لإزالة المرشح الذي يحتوي على ضابط المانح السلبي من طبق آجار LB. انقر على الأنبوب لجعل ورقة المرشح تستقر في قاع القارورة المخروطية، وتأكد من غمر المرشح بالكامل في وسط LB. يحتوي هذا الأنبوب على 2 mL من وسط LB مع IPTG بتركيز نهائي قدره 1 mM.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المزيج الدوامي (Vortex) لمدة دقيقة واحدة لفصل البكتيريا عن مرشح النيتروسليلوز. يجب أن يصبح وسط LB عكراً بوجود الخلايا البكتيرية. كرر هذه الخطوة لعينة التحكم بالمستقبل وللمكتبة أيضاً.

بعد رج المرشحات التي تحتوي على الخلايا البكتيرية جيداً باستخدام جهاز الـ vortex لفصل البكتيريا عن المرشح، يتم استزراع الخلايا البكتيرية على أوساط انتقائية. في هذه الخطوة، تُزرع البكتيريا في أطباق agar LB تحتوي على kanamycin ومضاد حيوي آخر مثل nalidixic acid. يُستخدم kanamycin لاختيار الخلايا المستقبلة التي تم فيها دمج الـ transposon المحتوي على علامة مقاومة kanamycin بنجاح في الجينوم.

يتم استبعاد الخلايا المستقبلة التي لم يتم دمج العلامة في جينومها. ويُستخدم مضاد حيوي آخر مثل حمض nalidixic acid لاستبعاد السلالة المانحة. وتكون السلالة المانحة المستخدمة هنا حساسة لحمض nalidixic acid، بينما تكون السلالة المستقبلة مقاومة لحمض nalidixic acid.

باستخدام هذا المضاد الحيوي الثاني، يمكن إزالة السلالة المانحة. في هذه الخطوة، يجب زراعة عدة تخفيفات على أطباق لتحديد التخفيف من المكتبة الذي ينتج العديد من المستعمرات المتباعدة بشكل كافٍ. بعد عد وتسجيل عدد المستعمرات في جميع الأطباق التي تحتوي على مكتبة الـ transposon، قد يرغب بعض المستخدمين في تجميع أو دمج المكتبة في أنبوب واحد.

يمكن القيام بذلك باستخدام ناشر معقم. أضف 1 mL من وسط LB إلى طبق LB agar الذي يحتوي على مكتبة transposon. وبمجرد إضافة الوسط إلى الطبق، استخدم الناشر المعقم لكشط البكتيريا وفصلها عن الطبق.

غالباً ما يكون من غير الممكن إزالة جميع البكتيريا من الطبق. قم بإزالة المعلق البكتيري ووضعه في أنبوب مخروطي سعة 50 مل أو 15 مل. كرر هذه العملية لجميع الأطباق.

بمجرد كشط جميع الأطباق، قم بمزج المعلق البكتيري المجمع باستخدام جهاز Vortex لمدة دقيقة كاملة لتفكيك أي تكتلات خلوية. يشكل هذا الآن المكتبة المجمعة. بعد النمو عند 37 درجة لمدة 18 ساعة، يجب ألا يكون هناك نمو في أطباق التحكم الخاصة بالمانح أو المستقبل.

من المثالي أن تحتوي الأطباق التي تضم مكتبة الطفرات على العديد من المستعمرات ذات الأحجام المتنوعة. وتشير أحجام المستعمرات المختلفة إلى وجود مستنسخات ذات لياقة متفاوتة، وهي علامة جيدة على نجاح البروتوكول. إن إنشاء مكتبة كثيفة من الطفرات الناقلة (transposon mutagenesis) في البكتيريا يعد مفيداً للعديد من التطبيقات اللاحقة، بدءاً من اكتشاف جينات الضراوة والمسببات المرضية البكتيرية، وصولاً إلى دراسة الجينات الأساسية وتحديد شبكات التفاعل الجيني.

تعتمد جميع هذه التطبيقات اللاحقة على إنشاء مكتبة كثيفة من إدخالات العناصر القافزة (transposon insertion library). وتوفر الطريقة المعروضة هنا إجراءً بسيطاً وسريعاً وغير مكلف لإنشاء مكتبة عناصر قافزة كثيفة للغاية في سلالات البكتيريا المعوية مثل E coli أو Shigella flexneri.