التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو

تتمثل الأهداف العامة لهذه المقايسات في تحديد كمية الانجذاب الكيميائي للخلايا الوحيدة في المختبر في الوقت الفعلي وتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية في الجسم الحي. يمكن أن تساعد طريقة المختبر في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل ما هي آثار عوامل المصل على الانجذاب الكيميائي للخلايا المناعية. الميزة الرئيسية لتقنية المختبر هي أنها تسمح بالقياسات الكمية والمتعددة في الوقت الفعلي.

يمكن أن تساعد طريقة in vivo في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة حول كيفية هجرة أنواع معينة من الخلايا داخل المتلقي. تعتبر تقنية in vivo مفيدة بشكل خاص للتقييم الكمي لهجرة أنواع الخلايا المتعددة داخل نفس. قبل بدء التجربة ، قم بتسمية خلايا THP-1 بصبغة فلورية في طبق زراعة خلية 35 ملم في وسط كامل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

أثناء احتضان الخلايا ، أضف 750 ميكرولترا من HBSS المخزنة ب 25 ملليمولار HEPES و 0.1٪ BSA إلى الخلفية وآبار التحكم الإيجابية للوحة 24 بئر. أضف التركيز المناسب من MCP-1 في المياه المكملة ب BSA إلى آبار التحكم التجريبية والإيجابية. ووضع إدخالات مسامية في كل بئر ، مع الحرص على محاذاة علامات تبويب الإدخالات مع شقوق اللوحة.

من الأهمية بمكان إزالة أي فقاعات من الآبار السفلية بعد وضع الإدخالات ، لأن الفقاعات ستتداخل مع قياسات الفلورة. في نهاية الحضانة ، انقل الخلايا المسمى إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر لجمعها عن طريق الطرد المركزي. وفحص الحبيبات الناتجة بصريا لتأكيد امتصاص الصبغة.

بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية بعناية وغسل الخلايا في وسط RPMI-1640 الخالي من المصل مكمل ب 25 ملليمولار HEPES في نفس ظروف أجهزة الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في وسط طازج خال من المصل باستخدام HEPES للعد. واضبط مستوى الصوت على تركيز نهائي من واحد إلى 1.5 في 10 أس الخلايا الست لكل مليلتر.

أضف 250 ميكرولترا من الخلايا إلى الغرفة العلوية لكل بئر وضع اللوحة في قارئ لوحة 37 درجة مئوية. ثم احصل على قراءات مضان للغرف السفلية على فترات من دقيقة إلى ثلاث دقائق عند الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث للصبغة. لتحضير الخلايا المانحة لنقلها بالتبني ، أولا ، قم بحصاد الطحال كله من ذكر مخدر يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعا C57 Black Six Mouse إلى مرشح شبكي من النايلون 40 ميكرومتر في طبق زراعة خلوي يحتوي على وسط كامل على الجليد.

باستخدام نهاية مكبس المحقنة ، نقع الطحال برفق من خلال الشبكة. عندما يتم الحصول على معلق خلية واحدة ، انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وأضف أربعة أحجام من محلول تحلل البوتاسيوم لكلوريد الأمونيوم لاستنفاد خلايا الدم الحمراء. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط كامل بتركيز اثنين إلى خمسة في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر.

قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون جديدة 40 ميكرومتر لإزالة بقايا الخلية. وقم بتسمية واحدة في 10 إلى الخلايا السبع لكل فأر متلقي بصبغة فلورية متوافقة مع الخلية الحية والتي سيتم الاحتفاظ بها عند التثبيت اللاحق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في أربعة أحجام من HBSS مكمل ب HEPES.

وأعد تعليق الحبيبات في HBSS الطازج بالإضافة إلى HEPES إلى واحد في 10 إلى الخلايا الثامنة لكل تركيز مليلتر. بعد ذلك ، قم بدوامة الخلايا المانحة لفترة وجيزة وتحميلها في حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 27 بوصة 0.5 بوصة. ضع الفئران المخدرة C57 السوداء الستة المتلقية التي يبلغ عمرها من ثمانية إلى 12 أسبوعا في وضع الانبطاح وقم بالضغط الذيلية الخفيف على الجلد الظهري لعين الأول ، مما يتسبب في بروز مقلة العين قليلا.

قم بتوجيه الإبرة وسطيا للحقن المداري الرجعي ل 100 ميكرولتر من الخلايا المانحة. بعد ذلك ، اسحب الإبرة تدريجيا وضع الماوس في قفص استرداد فردي مع المراقبة حتى الشفاء التام. من الأهمية بمكان أن يتم تخدير بشكل مناسب وأن يتم ممارسة إجراء الحقن بشكل جيد لضمان توصيل الخلايا بشكل متسق بين وعبر التجارب.

حتى 24 ساعة بعد النقل بالتبني ، قم بحصاد الطحال في مليلتر واحد من الوسط الكامل لكل متلقي. وتوليد معلق خلية واحدة خالية من خلايا الدم الحمراء كما هو موضح للتو. بعد العد ، اضبط تعليق الخلية على ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا السبع لكل تركيز مليلتر في مخزن التلوين.

وانقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى آبار فردية من صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا. قم بتلطيخ الخلايا لعلامات الاهتمام وفقا لبروتوكولات تحليل قياس التدفق الخلوي القياسية. بعد 20 دقيقة على الجليد المحمي من الضوء ، اغسل الخلايا في 100 ميكرولتر من مخزن التلوين المؤقت وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من مخزن التلوين الطازج لجهاز طرد مركزي ثان.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 125 ميكرولتر من مخزن التلوين الطازج وقم بتحليل عينات الخلية على مقياس التدفق الخلوي وفقا للبروتوكولات القياسية. تظهر قراءات الفلورسنت الآلية لتتبع الهجرة بوضوح تحريض هجرة الخلايا نحو MCP-1 التي يتم زيادتها في وجود المصل. اعتمادا على قوة المنبه المهاجر ، هناك تأخر لا يقل عن 15 دقيقة قبل زيادة إشارة الفلورسنت التي قد تصل إلى ذروتها وتنخفض تدريجيا مع مرور الخلايا إلى المحلول إلى الغرفة السفلية من الجانب السفلي من الإدخال بمعدل أسرع من تلك الموجودة في الخلايا المهاجرة من الغرفة العلوية.

إذا تم نقل أكثر من مجموعة خلايا مصنفة بالفلورسنت بالتبني ، فمن المهم تحديد النسبة النسبية لمجموعات الخلايا داخل مادة الإدخال لحساب أي تباين في خلط مجموعات الخلايا. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، كانت نسبة الخلايا الفلورية الخضراء والبرتقالية 0.97 إلى واحد. تم تحديد كمية الاتجار على أنه عدد الخلايا المصنفة التي تم استردادها مقسوما على العدد الإجمالي للخلايا التي تم استردادها.

في حين أن هناك تباينا كبيرا في عدد الخلايا المستردة بين ، فإن نسبة الخلايا الفلورية الخضراء إلى البرتقالية بالنسبة لأي معين عادة ما تكون متساوية تقريبا. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية المختبر في أربع ساعات ، ويمكن إكمال تقنية in vivo في ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب تكوين فقاعات في الغرف التجريبية والسعي لتحقيق الاتساق أثناء الحقن المداري الرجعي للخلايا المنقولة بالتبني.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف الانجذاب الكيميائي في المختبر وفي الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ومراقبة اختبار الانجذاب الكيميائي في المختبر في الوقت الفعلي وعزل الخلايا الليمفاوية الأصلية لنقلها بالتبني وتتبع هجرتها في الجسم الحي. شكرا على المشاهدة ، ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.