أسلوب للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات المجهرية في مجهر إلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو عمل مقاطع متسلسلة فائقة الرقة بشكل آمن وسهل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الخلية، من خلال توفير معلومات هيكلية كمية وثلاثية الأبعاد لخلية كاملة على مستوى المجهر الإلكتروني. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إجراء القطع المتسلسل فائق الرقة دون الحاجة إلى جهاز باهظ الثمن، مع إمكانية الحصول على صور عالية الدقة باستخدام هذه الطريقة.

لبدء هذا الإجراء، قم بتنظيف سطح شريحة زجاجية. ثم اغمس نصف الشريحة الزجاجية في محلول Formvar بتركيز 1.5% في العمود العلوي من جهاز تصنيع أغشية دعم Formvar، وذلك عن طريق دفع المحلول بالهواء عبر صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات باستخدام كرة مطاطية. قم بتصريف المحلول من العمود عن طريق فتح صمام الإيقاف ثلاثي الاتجاهات وتحرير الهواء لتقليل الضغط.

بعد ذلك، أخرج الشريحة الزجاجية من الجهاز، واتركها تجف في الهواء لتكوين غشاء على سطح الشريحة الزجاجية. قم بكشط الحواف الأربعة للغشاء الموجود على الشريحة الزجاجية باستخدام شفرة حلاقة. وبعد النفخ على الشريحة لتسهيل فصل الغشاء عنها، قم بإزالة الغشاء عن طريق غمر الشريحة الزجاجية في الماء ببطء وبزاوية أفقية منخفضة.

ثم ارفع غشاء Formvar من الماء باستخدام حامل ألومنيوم مثقوب. لتقليم كتلة العينة باستخدام شفرة تقليم فوق صوتية وشفرة حلاقة تحت مجهر ستريو، تأكد أولاً من وجود خلايا على سطح الكتلة من خلال فحص طرف الكتلة باستخدام مجهر ضوئي. بعد ذلك، قم بتثبيت كتلة العينة في القابض، ثم ثبّت القابض على منصة التقليم.

قم بقص الكتل إلى حجم 0.7 في 1.0 مليمتر. إذا كان راتنج الإيبوكسي صلباً جداً، فقم بقص الصندوق أولاً باستخدام شفرة قص بالموجات فوق الصوتية، ثم أكمل قص الكتلة باستخدام شفرة حلاقة. قم بقص كتف واحدة لتحديد اتجاه القص.

لتقليم كتلة العينة باستخدام سكين ماسية بواسطة الميكروتوم، ضع ظرف كتلة العينة في حامل العينات الخاص بالميكروتوم الفائق. قم بقص سطح الكتلة باستخدام سكين تقليم ماسية. اجعل حافة السكين الماسية موازية لوجه كتلة العينة، وقم بقص أقل قدر ممكن من سطح العينة لتجنب فقدان أي جزء منها.

قص الحافة اليسرى للكتلة باستخدام سكين التشذيب عن طريق تدوير منصة السكين بمقدار 30 درجة إلى اليسار. تصبح هذه الحافة هي الجانب العلوي للعينة في عملية القطع المتسلسل. ثم قص وجه الكتلة على مسافة 100 ميكرون تقريبًا من الحافة اليسرى للعينة عن طريق تدوير منصة السكين بمقدار 30 درجة إلى اليمين.

تصبح هذه الحافة هي الجانب السفلي للعينة عند إجراء القطع المتسلسل. قم بإزالة سكين التشذيب، وقم بتدوير كتلة العينة بمقدار 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة. ثبّت سكين قطع فائق الرقة على منصة السكاكين.

قم بضبط سطح العينة وحافة السكين بحيث يكونان متوازيين باستخدام الجزء الأكبر من سطح العينة. بعد ذلك، ضع شريطاً لاصقاً على حامل العينة وماسك الحامل في الميكروتوم، ثم اقطع الشريط عند الحد الفاصل. أخرج حامل العينة من الميكروتوم وضعه تحت المجهر الستيريو.

اقطع الجزء الكبير من العينة باستخدام شفرة حلاقة، مع ترك الجزء النحيف الذي سيتم الحصول منه على المقاطع المتسلسلة. اجعل جوانب المقطع لاصقة باستخدام ماصة باستور لتقطير حوالي 1 µL من محلول نيوبيرين بتركيز 0.5% على العينة المراد استخدامها للمقاطع المتسلسلة. بعد ذلك، غطِّ العينة بأكملها بمحلول النيوبيرين. امتص محلول النيوبيرين الزائد فوراً باستخدام قطعة من ورق الترشيح توضع بالقرب من العينة.

بعد ذلك، قم بتحضير ثلاث شبكات شقية (slit grids) لالتقاط المقاطع المتسلسلة. وللقيام بذلك، اثنِ مقبض الشبكات بزاوية 60 درجة، وعالج الشبكات بمحلول Neoprene بتركيز 0.5%. ثم اجعل الشبكات محبة للماء (hydrophylic) باستخدام تفريغ التوهج (glow discharge).

أعد وضع ظرف كتلة العينة في الميكروتوم في نفس الموضع من خلال محاذاة الأجزاء المثبتة بالشريط اللاصق. يضمن ذلك بقاء وجه الكتلة وحافة السكين متوازيين تماماً. بعد ذلك، قرّب السكين من العينة.

بعد ملء حوض السكين بالماء، غطِّ الميكروتوم بغطاء بلاستيكي لمنع تدفق الهواء. ابدأ بتقطيع العينة بسمك مقطع يبلغ 200 nanometers. وبعد قطع المقطع الأول، اضبط سمك المقطع ليكون 70 nanometers.

عندما يصل عدد المقاطع المتسلسلة إلى 20، اضبط سمك المقطع على 10 نانومتر. وبما أن الميكروتوم لا يمكنه قطع مقاطع بسمك 10 نانومتر، فلن يظهر أي مقطع جديد، وستنفصل المقاطع التي تم قطعها سابقاً عن حافة السكين. بعد ذلك، اضبط سمك المقطع على 60 نانومتر.

سينتج عن ذلك مقاطع بسمك 70 نانومتر لأن الجهاز سيضيف سمك الـ 10 نانومتر السابق. وأخيراً، أعد ضبط سمك المقطع إلى 70 نانومتر، واستمر في القطع حتى يتم الحصول على مقاطع بطول 1.8 مليمتر. لالتقاط المقاطع المتسلسلة، ضع أولاً حلقة تثبيت المقاطع على مجموعة المقاطع الثالثة.

ثم ضع حلقة رفع سطح الماء على منصة السكين. ضع حلقة الـ WSRL فوق المقاطع المتسلسلة مباشرة عن طريق تحريك عمودها ومقبضها. اخفض حلقة الـ WSRL على سطح الماء بحيث تحيط الحلقة بالمقاطع.

ادفع الحلقة للأسفل عن طريق تدوير المسمار لأسفل بحيث يرتفع سطح الماء بفعل التوتر السطحي. حرك المقطع إلى مركز الحلقة. ضعه على قمة سطح الماء واضبط اتجاه المقطع باستخدام خصلة شعر.

التقط مجموعات المقاطع بملامستها بشبكة شقوق عارية، وذلك بمساعدة ملقط مع الحفاظ عليها موازية لسطح الماء. ضع الشبكات التي تحتوي على المقاطع مع قطرة صغيرة من الماء فوق غشاء الدعم Formvar. قم بإزالة الماء الزائد باستخدام ورق ترشيح.

بعد جفاف المقاطع تماماً، قم بتمزيق غشاء Formvar حول الشبكات؛ ثم استخرج الشبكات التي تحمل المقاطع. ضع الشبكات في أخدود أنبوب الصبغ بالترتيب الصحيح، وقم بصبغ المقاطع باستخدام أسيتات اليورانيل وسترات الرصاص. ضع الشبكات الخمس في حامل العينات المتعدد بالترتيب الصحيح، مع توجيه المحور الطولي لشق الشبكة بشكل عمودي على محور حامل العينات.

قم بتثبيت الشبكة باستخدام مثبتات الشبكة، ثم أدخل حامل العينة في المجهر الإلكتروني النافذ. ابدأ بالتقاط صور للخلايا المستهدفة وجميع المقاطع الخلوية بتكبير عالٍ. يظهر هنا عرض منخفض التكبير لخمس شبكات تحمل مقاطع متسلسلة.

تم تثبيت 18-25 مقطعاً على شبكة واحدة. يرجى ملاحظة أن المقاطع متصلة ببعضها البعض ولها نفس السمك. تظهر هنا مقاطع متسلسلة لتكون العضلات في الجسم الرئيسي (pericarion).

يوضح الشكل 12 مقطعاً من أصل 67 مقطعاً كاملاً. وقد وُجد أن هذه الخلية تحتوي على نووية كبيرة تتكون من ألياف DNA عارية مع غشاء نووي واحد ومتكافلات داخلية تشبه البكتيريا ولكن بدون ميتوكوندريا. وبناءً على ذلك، يبدو أن هذا الكائن يمثل شكلاً حياتياً وسيطاً يتطور من بدائية النواة إلى حقيقية النواة.

تظهر هنا مقاطع متسلسلة من بكتيريا Escherichia coli. ويظهر الشكل 12 مقطعاً كاملاً. ومن المثير للاهتمام أن هذه الخلية وُجد أنها تحتوي على 21,700 ريبوسوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مقاطع متسلسلة فائقة الرقة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثلاث ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.