أسلوب للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات المجهرية في مجهر إلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو عمل أقسام تسلسلية فائقة النحافة بأمان وسهولة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، وتوفير معلومات هيكلية كمية وثلاثية الأبعاد لخلية كاملة على المستوى المجهري الإلكتروني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء التقسيم التسلسلي فائق النحافة بدون آلة باهظة الثمن ، ويمكن الحصول على صور عالية الدقة بهذه الطريقة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتنظيف سطح الشريحة الزجاجية. ثم اغمس نصف الشريحة الزجاجية في محلول فورمفار بنسبة 1.5٪ في العمود العلوي من جهاز صناعة الأفلام الداعم Formvar عن طريق الضغط على المحلول بالهواء من خلال محبس ثلاثي الاتجاهات باستخدام كرة مطاطية. قم بتصريف المحلول من العمود عن طريق فتح محبس ثلاثي الاتجاهات وإطلاق الهواء لتقليل الضغط.

ثم أخرج الشريحة الزجاجية من الجهاز ، وجففها في الهواء لتشكيل فيلم على سطح الشريحة الزجاجية. اكشط الحواف الأربعة للفيلم على الشريحة الزجاجية بشفرة حلاقة. بعد التنفس على الشريحة لتسهيل فصل الفيلم عن الشريحة ، قم بتعويم الفيلم عن طريق غمر الشريحة الزجاجية في الماء ببطء بزاوية أفقية منخفضة.

ثم اغرف فيلم Formvar من الماء باستخدام رف من الألومنيوم به ثقوب. لقص كتلة العينة بشفرة تشذيب بالموجات فوق الصوتية وشفرة حلاقة تحت مجهر استريو ، تأكد أولا من وجود خلايا على سطح الكتلة من خلال مراقبة طرف الكتلة بمجهر ضوئي. ثم قم بتركيب كتلة العينة في الظرف ، وقم بتركيب ظرف على مرحلة التشذيب.

قم بقص الكتل بحجم 0.7 × 1.0 ملم. إذا كان راتنجات الايبوكسي صلبا جدا ، فقم بقص الصندوق أولا باستخدام شفرة تشذيب بالموجات فوق الصوتية ، ثم قم بقص الكتلة بشفرة حلاقة. قطع كتف واحد لتحديد اتجاه القطع.

لقص كتلة العينة بسكين ماسي باستخدام الميكروتوم ، ضع ظرف كتلة العينة في حامل العينة من الميكروتوم الفائق. قطع سطح الكتلة بسكين تشذيب الماس. ضع حافة السكين الماسي موازية لوجه كتلة العينة ، وقم بقص الحد الأدنى من سطح العينة حتى لا تفقد أي عينة.

اقطع الحافة اليسرى للكتلة باستخدام سكين التشذيب عن طريق تدوير مرحلة السكين 30 درجة إلى اليسار. تصبح هذه الحافة هي الجانب العلوي من العينة في التقسيم التسلسلي. ثم قم بقص وجه الكتلة عند حوالي 100 ميكرون من الحافة اليسرى للعينة عن طريق تدوير مرحلة السكين 30 درجة إلى اليمين.

تصبح هذه الحافة هي الجانب السفلي من العينة في التقسيم التسلسلي. قم بإزالة سكين التشذيب ، وقم بتدوير كتلة العينة 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة. ضع سكين تقطيع رفيع للغاية على مرحلة السكين.

اضبط سطح العينة وحافة السكين بحيث يواجهان متوازيين مع بعضهما البعض باستخدام الجزء الكبير من سطح العينة. بعد ذلك ، ضع شريطا على ظرف وحامل ظرف الميكروتوم ، وقم بقص الشريط عند الحدود. أخرج ظرف العينة من الميكروتوم وضعه تحت المجهر الاستريو.

اقطع الجزء الكبير من العينة بشفرة حلاقة تاركا الجزء النحيف الذي سيتم الحصول على الأقسام التسلسلية منه اجعل جوانب القسم لاصقة باستخدام ماصة باستور لإسقاط حوالي ميكرولتر واحد من 0.5٪ من محلول النيوبرين على العينة لاستخدامها في التقسيم التسلسلي. ثم قم بتغطية العينة بأكملها بمحلول النيوبرين. امتصاص محلول النيوبرين الزائد على الفور بقطعة من ورق الترشيح الموضوعة بالقرب من العينة.

بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاث شبكات شقية لالتقاط الأقسام التسلسلية. للقيام بذلك ، قم بثني مقبض الشبكات إلى 60 درجة ، وقم بمعالجة الشبكات بمحلول 0.5٪ من النيوبرين. ثم اجعل الشبكات مائية عن طريق تفريغ التوهج.

ضع ظرف كتلة العينة مرة أخرى في الميكروتوم في نفس الموضع عن طريق محاذاة الأجزاء المسجلة. هذا يحافظ على وجه الكتلة وحافة السكين متوازيين تماما مع بعضهما البعض. ثم اجعل السكين قريبا من العينة.

بعد ملء قارب السكين بالماء ، قم بتغطية الميكروتوم بغطاء بلاستيكي لمنع تدفق الهواء. ابدأ في قطع العينة بسمك قسم 200 نانومتر. بعد قطع القسم الأول ، اضبط سمك القسم على 70 نانومتر.

عندما يصل عدد الأقسام التسلسلية إلى 20 ، اضبط سمك القسم على 10 نانومتر. نظرا لأن الميكروتوم لا يمكنه قطع أقسام بسمك 10 نانومتر ، فلا يظهر قسم جديد ، ويتم فصل الأقسام المقطوعة مسبقا عن حافة السكين. بعد ذلك ، اضبط سمك القسم على 60 نانومتر.

سينتج عن ذلك 70 مقطعا نانومترا لأن الماكينة ستضيف سمك 10 نانومتر سابق. أخيرا ، اضبط سمك القسم مرة أخرى على 70 نانومتر ، واستمر في القطع حتى يتم الحصول على أقسام بطول 1.8 ملم. لالتقاط الأقسام التسلسلية ، ضع أولا حلقة تثبيت القسم في مجموعة القسم الثالث.

ثم ضع حلقة رفع سطح الماء على مرحلة السكين. ضع حلقة WSRL فوق الأقسام التسلسلية مباشرة عن طريق تحريك عمودها ومقبضها. قم بخفض حلقة WSRL على سطح الماء بحيث تحيط الحلقة بالأقسام.

ادفع الحلقة لأسفل عن طريق تدوير المسمار لأسفل بحيث يتم رفع سطح الماء عن طريق التوتر السطحي. انقل القسم إلى منتصف الحلقة. ضعه على قمة الماء واضبط اتجاه القسم باستخدام خصلة شعر.

التقط مجموعات الأقسام عن طريق لمسها بشبكة شق عارية ، والتي تساعدها الملقط وتبقى موازية لسطح الماء. ضع الشبكات ذات الأقسام جنبا إلى جنب مع قطرة صغيرة من الماء على فيلم دعم Formvar. قم بإزالة الماء الزائد باستخدام ورق الترشيح.

بعد تجفيف الأقسام تماما ، قم بتمزيق فيلم Formvar حول الشبكات ؛ وإزالة الشبكات التي تحمل الأقسام. اضبط الشبكات في أخدود أنبوب التلوين بالترتيب الصحيح ، وصمة عار الأقسام بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص. اضبط الشبكات الخمس في حامل العينات المتعددة بالترتيب الصحيح ، مع توجيه المحور الطويل لشق الشبكة بشكل عمودي على محور حامل العينة.

قم بإصلاح الشبكة باستخدام مثبتات الشبكة ، وأدخل حامل العينة في المجهر الإلكتروني للإرسال. تابع التقاط صور للخلايا المستهدفة وجميع أقسام الخلايا بتكبير عالي. يظهر هنا عرض تكبير منخفض لخمس شبكات تحمل أقساما تسلسلية.

تم تركيب 18-25 قسما على شبكة واحدة. لاحظ أن الأقسام متصلة ببعضها البعض ولها نفس السماكة. يتم عرض الأقسام التسلسلية لتكوين عضل الحضيض هنا.

الشكل 12 من أصل 67 قسما كاملا. وجد أن هذه الخلية تحتوي على نواة كبيرة تتكون من ألياف DNA عارية مع غشاء نووي واحد وتكافل داخلي يشبه البكتيريا ولكن لا يوجد ميتوكوندريا. وبالتالي ، يبدو أن هذا الكائن الحي هو شكل حياة وسيط يتطور من بدائيات النوى إلى حقيقيات النوى.

تظهر هنا أقسام متسلسلة من الإشريكية القولونية. يوضح الشكل 12 قسما كاملا. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور على هذه الخلية لاحتوائها على 21،700 ريبوسوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل أقسام متسلسلة فائقة النحافة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.