Ca المتقدرية^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca^{2 +}--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم في تورم الميتوكوندريا الناجم عن الكالسيوم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا، مثل التمثيل الغذائي غير الطبيعي للطاقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وفعالة للغاية.

للبدء ، قم بزرع حوالي ثلاثة ملايين خلية SH-SY5Y لكل طبق زراعة خلية 10 سنتيمترات. قم بإزالة الوسيط واغسل الخلايا بحوالي ملليلتر واحد من PBS المثلج في طبق ثقافة خلية 10 سم ثلاث مرات. أضف ملليلترا واحدا من PBS المثلج البارد إلى طبق زراعة الخلايا الذي يبلغ طوله 10 سم وكشط الخلايا الملتصقة في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

جهاز طرد مركزي عند 800 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد خمسة ملليلتر من عازلة عزل الميتوكوندريا ، مع استكمال 50 ميكرولترا من محلول مخزون مثبطات البروتياز قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات باستخدام مليلتر واحد من عازلة عزل الميتوكوندريا.

احتضان الأنبوب سعة 1.5 مل على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا العالقة باستخدام الخالط الزجاجي ، لأعلى ولأسفل يدويا على الجليد. انقل الجانس إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 1 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الحطام. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل قبل الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل. بعد نقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، قم بعمل جهاز طرد مركزي عند 14،000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على الميتوكوندريا مع ملليلتر واحد من عازلة عزل الميتوكوندريا. ثم الطرد المركزي المحلول لمدة 15 دقيقة عند 14،000 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية لترسيب الميتوكوندريا. يجب الاحتفاظ بحبيبات الميتوكوندريا الناتجة على الجليد وإعادة تعليقها في 50 إلى 100 ميكرولتر من وسائط كلوريد البوتاسيوم, وفقا لحجم الحبيبات قبل أي فحص.

أخيرا ، استخدم خمسة ميكرولترات من محلول الميتوكوندريا لقياس تركيز بروتين الميتوكوندريا عن طريق مقايسة BCA القياسية ، وقياس OD562 باستخدام قارئ لوحة. قم بإعداد وسط كلوريد البوتاسيوم وأضف صبغة الفلورسنت الخضراء المرتبطة بالكالسيوم إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومولار قبل التجربة. لتحديد قدرة احتباس الكالسيوم في الميتوكوندريا ، قم أولا بنقل مليلتر واحد من الميتوكوندريا المعزولة في وسط كلوريد البوتاسيوم الذي يحتوي على صبغة فلورية خضراء ملزمة بالكالسيوم 0.5 ميكرومولار إلى كل بئر من ستة ألواح آبار.

احتضان الميتوكوندريا وصبغة الفلورسنت الخضراء الملزمة بالكالسيوم في صفيحة الآبار الستة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء المحيط لمدة دقيقة واحدة. بعد الحضانة ، أضف أربعة كميات ميكرولتر في محلول كلوريد الكالسيوم 20 ملليمولار إلى كل بئر من صفيحة الآبار الستة باستخدام إعداد التوزيع التلقائي لإدخال 200 نانومول من الكالسيوم لكل ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا. استخدم مطياف الفلورسنت لمراقبة تغيرات التألق كل ثلاث ثوان لمدة دقيقتين بطول موجة إثارة يبلغ 506 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 531 نانومتر.

تجهيز اللوحة بالاهتزاز عند 600 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث ثوان بين القراءات ، يتم التحكم فيها بواسطة البرنامج. أضف أربعة ميكرولترات إضافية من محلول كلوريد الكالسيوم 20 مليمولار لكل بئر ، ثم راقب التغيرات الفلورية كل ثلاث ثوان لمدة دقيقتين. لتحديد تورم الميتوكوندريا الناجم عن الكالسيوم ، انقل ملليلتر واحد من الميتوكوندريا المعزولة في وسط كلوريد البوتاسيوم إلى كل بئر من ستة آبار.

ثم أضف 10 ميكرولترات من محلول مائي من كلوريد الكالسيوم 20 مللي مولار إلى بروتين الميتوكوندريا لتحفيز تورم الميتوكوندريا. باستخدام قارئ صفيحة دقيقة يتم التحكم فيه بواسطة البرنامج ، سجل الانخفاض في الامتصاص كل ثلاث ثوان لمدة 10 دقائق عند 540 نانومتر. النتائج التمثيلية لقدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم من bongkrekic ، وهو مثبط للمسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا الناجم عن الكالسيوم ، أو MPTP ، وفتح atractyloside ، وهو منشط لفتح MPTP المستحث بالكالسيوم والتحكم الفارغ ، هنا.

القدرة على في علاج bongkrekic أعلى بكثير من مجموعة atractyloside, كما هو متوقع. تظهر هنا النتائج التمثيلية لتورم الميتوكوندريا الناجم عن الكالسيوم في بونغكريكيك وأتركيلوسيد والتحكم في عدم العلاج. يشير انخفاض الامتصاص الذي تم رصده عند 540 نانومتر إلى تورمات الميتوكوندريا.

تشير النتائج إلى أن BKA يمكن أن تمنع فتح MPTP ، بينما يمكن ل ATR تسهيل فتح MPTP. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بجميع الحلول على الجليد.