Name: Ca المتقدرية2 + الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca2 +--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: تعلم قياس احتفاظ المتقدرات بالكالسيوم وتورمها المُحفز بالكالسيوم في خلايا SH-SY5Y العصبية. يوفر هذا البروتوكول البسيط رؤى حول وظائف المتقدرات وآليات الخلل الأيضي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذه الدراسة المنح من المنح "المعلقة من عالم شاندونغ" (JQ201421) ومنحة من تشرف (81371226).

1-عزل الميتوكوندريا
ملاحظة: جميع الحلول والمعدات ينبغي أن بريكوليد إلى 0-4 درجة مئوية وأبقى على الجليد.
<ol><li>البذور حوالي 3 × 106 ش-SY5Y الخلايا الواحدة 10 سم خلية الثقافة الطبق. تعديل الخلايا الثقافة في دولبيكو الجلوكوز عالية متوسطة النسر مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين (100 U/mL)-ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل). الحفاظ على 37 درجة مئوية في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO2 بين عشية وضحاها. ملاحظة: هناك حاجة على الأقل 1-2 × 107 ش-SY5Y الخلايا للمقايسة عزل كل.</li>
	<li>إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد في طبق ثقافة خلية 10 سم 3 مرات.</li>
	<li>إضافة جديد 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في الطبق ثقافة الخلية 10 سم وكشط الخلايا ملتصقة في أنبوب 1.5 مل جديدة. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>أثناء الطرد المركزي، إعداد 5 مل العزلة المتقدرية المخزن المؤقت (250 ملم السكروز، 10 مم حبيس (حمض اثانيسولفونيك-(2-hydroxyethyl)-1-الببرازين 4)، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل2، يدتا 1 مم) وتستكمل مع 50 ميكروليتر من الأسهم مثبطات البروتياز الحل (100 x تركيز؛ 1 قرص خالية يدتا حله في 500 ميليلتر من ddH2س).</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 1 مل من العزلة المتقدرية المخزن المؤقت. احتضان أنبوب 1.5 مل على الجليد لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>الخلايا مع وقف التنفيذ مع الخالطون زجاج (15-25 السكتات الدماغية) صعودا وهبوطاً يدوياً على الجليد. ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات عندما يتم تجانس خلايا. حساب عدد الخلايا سليمة ونوى البارد بالمجهر بصريا، والتأكد من أن > حدث الكسر الخلية 90%.</li>
	<li>نقل هوموجيناتي إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لإزالة الأنقاض (الأنوية والخلايا المتبقية سليمة).</li>
	<li>نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق 4 درجات مئوية.</li>
	<li>نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14,000 س ز 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه المحتوية على الميتوكوندريا مع 1 مل من العزلة المتقدرية المخزن المؤقت.</li>
	<li>الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة في س 14,000 ز 4 درجة مئوية التعجيل في الميتوكوندريا.</li>
	<li>بيليه الميتوكوندريا الناتجة عن ذلك يجب أن أبقى على الجليد وحراكه في 50-100 ميكروليتر بوكل الوسائط (125 ملم بوكل 2 مم ك2هبو4، 1 مم مجكل2، 20 مم حبيس، غلوتامات 5 مم، مالات 5 مم، و 2 ميكرومتر والروتينون، درجة الحموضة 7.4) وفقا لحجم بيليه قبل أي الحمار المنعم يوسف.</li>
	<li>استخدام 5 ميكروليتر من حل المتقدرية لقياس تركيز البروتين المتقدرية بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي القياسية، قياس OD562 باستخدام قارئ لوحة13.</li>
</ol>2. تحديد قدرة المتقدرية Ca2 + الاحتفاظ
<ol><li>تحضير الوسائط بوكل وإضافة Ca2 +-ربط صبغة الفلورسنت الخضراء إلى تركيز 0.5 ميكرومتر قبل التجربة الأخيرة.</li>
	<li>نقل 1 مل الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ/مل) في بوكل الوسائط التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر Ca2 +-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء في كل لوحة 6-جيدا جيدا.</li>
	<li>احتضان الميتوكوندريا و Ca2 +-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء في لوحة 6-جيدا في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء المحيط لمختبرين ميكروليتر 4 إضافة 1 كحد أدنى من 20 مم كاكل2 الحل (20 مم كاكل2، 127 مم بوكل، 1 مم مجكل2 ، 20 مم حبيس، غلوتامات 5 مم، ومآلات 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) لكل لوحة 6-جيدا جيدا باستخدام التلقائي الاستغناء عن الإعداد لإدخال 200 نمول Ca2 +المتقدرية/mg بروتين.</li>
	<li>استخدم مطياف الأسفار رصد التغيرات الأسفار كل 3 ثانية لمدة 2 دقيقة مع الطول موجي إثارة من 506 شمال البحر الأبيض المتوسط وطول موجي انبعاثات من 531 شمال البحر الأبيض المتوسط. اللوحة مجهز بالهز 600 لفة في الدقيقة ل 3 s بين القراءات التي تسيطر عليها البرمجيات (الشكل 1).</li>
	<li>إضافة قاسمة ميكروليتر 4 إضافية من عيار 20 ملم كاكل2 الحل لكل بئر ورصد التغييرات الأسفار كل 3 s للحد الأدنى 2 كرر هذه الخطوة حتى الأسفار يزداد مع الوقت. ملاحظة: يتم تحدي الميتوكوندريا مع إضافة Ca2 + المؤشرة fluorescence تسجيل زيادة. عندما يفتح مبتب، يزيد الأسفار مع مرور الوقت.</li>
	<li>تفسير المبلغ الإجمالي من Ca2 + إضافة حتى يفتح مبتب ك Ca2 + الاحتفاظ بقدرة.</li>
</ol>3-تحديد Ca 2 +-الناجم عن تورم المتقدرية
<ol><li>تعد وسائل الإعلام بوكل قبل التجربة.<ol>
<li>نقل 1 مل الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ/مل) في وسائل الإعلام بوكل في كل لوحة 6-جيدا جيدا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 10 ميكروليتر من عيار 20 ملم كاكل2 محلول مائي (500 مغ/نمول المتقدرية بروتين) في البروتين تؤدي إلى تورم المتقدرية mitochondrial.</li>
	<li>تسجيل الانخفاض في امتصاص في 540 نانومتر كل 3 s على قارئ ميكروسكوبية التي تسيطر عليها برامج لمدة 10 دقائق (الشكل 2). بسبب التغييرات fluorescence تدفق الذوائب عبر الغشاء الداخلي المتقدرية. ملاحظة: انخفاض امتصاص في 540 نانومتر يناظر الميتوكوندريا منتفخة. إذا كان القارئ لا نلاحظ انخفاض في امتصاص، يمكن اعتماد القراءة فاصل زمني أطول أو وقت القراءة.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

عاشرا – الشمس الإشراف على التجارب. لي وي إجراء التجارب. تشانغ تشن وعاشرا الشمس كتب الورق.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة المتقدرية Ca2 + الاحتفاظ بقدرة التحليل و Ca2 +-أثارت المقايسة تورم المتقدرية.
لعزل المتقدرية، تأكد من أن جميع المواد وأنابيب يتم على الجليد، لا سيما عند المجانسة الخلايا. 0.25% التربسين-يدتا يمكن أن تستخدم أيضا لفصل الخلايا من الطبق لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد 15-25 من السكتات الدماغية، من الضروري مراقبة سليمة غشاء الخلية تحت المجهر، وتجنب الكسر للغشاء الميتوكوندريا. ولكن الميتوكوندريا المعزولة التي حصلنا عليها الميتوكوندريا ا...

الميتوكوندريا هي الأجهزة الخلوية الرئيسية لإنتاج ما يقرب من 95 في المائة ATP تستخدمها الفسفرة في خلايا الثدييات. وأفيد أن يلتقيه micromolar تركيز Ca2 + من الميتوكوندريا، ووجود ADP والفوسفات غير العضوية يمكن أن فوسفوريلاتي ADP إلى ATP توليف1. عندما يذهب تركيز Ca سيتوسوليك2 + عتبة، الميتوكوندريا يمكن امتصاص Ca2 + سرعة وافلوكس ذلك ببطء. وهكذا، يمكن الميتوكوندريا الأداء تدفق زيادة سيتوسوليك Ca2 +. لا صلة لها بالمشاركة في الفسفرة، كاليفورنيا المتقدرية2 + أيضا المشاركة في إشارات الكالسيوم سيتوسوليك وتنشيط إليه apoptotic الميتوكوندريا بحمل فتح مبتب في الداخلية المتقدرية غشاء2. وقد اعترف على نطاق واسع أن ارتفاع غير طبيعي في كاليفورنيا داخل الخلية2 + يمكن أن تحدث تورم المتقدرية الضخمة عن طريق فتح مبتب3. وهكذا، وهذا البروتوكول يهدف إلى تقييم الوظيفة المتقدرية بقياس المتقدرية Ca2 + الاحتفاظ بالقدرات و Ca2 +-تسبب تورم المتقدرية.
Ca2 + الاحتفاظ بالقدرات هو قياس قدرة الميتوكوندريا على امتصاص الكالسيوم سيتوسوليك. يمكن المخزن المؤقت الكالسيوم الحر سيتوسوليك الميتوكوندريا وتنظيم العمليات الخلوية المعتمدة على الكالسيوم عن طريق امتصاص الكالسيوم في شكل رواسب غير نشط. يحدث البصر Ca2 + القدرة على الاحتفاظ في الإجهاد الظواهر المرتبطة بالحد من الطاقة والأعصاب حتى الأمراض4،5. الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا بيرميبيليزيد ديجيتونين يمكن استخدامها لتحديد Ca2 + الاحتفاظ بالقدرة، وقدرة مرتفعة على تراكم Ca2 + من الميتوكوندريا المعزولة مع غلوتامات الإضافي ومآلات لا يتم عزل المتقدرية الداخلي6. ينبغي استخدام كمية معاير من ديجيتونين بيرميبيليزي في الأغشية البلازمية من أنواع مختلفة من الخلايا. ملح هيكسابوتاسيوم Ca2 +-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء، Ca2 +-خلية إيمبيرمينت الحساسة تظهر مؤشر الضوء منفعل، كانت تستخدم على نطاق واسع7. Ca2 +-ملزمة الخضراء صبغة الفلورسنت هو مؤشر تقارب منخفضة وتستخدم لإظهار أن داخل الخلايا الحرة Ca2 + تركيزات يواصل الارتفاع خلال فترات طويلة (5 دقائق) التحفيز8. هذا الأسلوب هو أقل حساسية من تقنية تصفية المشعة ولكن تم تبسيطها إلى حد كبير. Ca إضافية2 + يرفع fluorescence الكالسيوم الأخضر وترجع Ca2 + امتصاص الميتوكوندريا الأسفار لخط الأساس. وقدمت إضافات متتالية من Ca2 + حتى الميتوكوندريا فشل في امتصاص اكستراميتوتشوندريال Ca2 + 9. يمكن استخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار لتقرير الأسفار الكالسيوم الخضراء باستمرار.
بعد Ca2 + تراكم، depolarized الميتوكوندريا، إصدار Ca2 + في المتوسط، وبدأ الإنتفاخ. Ca2 +--تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. المجهر الإلكتروني، والانخفاض في امتصاص الضوء في 540 نانومتر يمكن استخدامها لقياس Ca2 +-تسبب تورم المتقدرية10،11. يمكن تحديد حجم الميتوكوندريا مباشرة بواسطة زاوية الأمام تشتت الضوء12، حيث تعكس انخفاض امتصاص سلبية تورم المتقدرية المصفوفة.
هنا، نحن توضيح المنهجية لدراسة المتقدرية Ca2 + الاحتفاظ بالقدرات و Ca2 +-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>خط الخلية SH-SY5Y</td><td>ATCC (المركز العالمي للموارد الحيوية)</td> <td>رقم ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>الكالسيوم الأخضر -5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2 + ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء</td></tr><tr><td>مثبطات البروتياز الكاملة</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>الخالط الزجاجي</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>الغلوتامات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>مالات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>روتينون</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>هيبس</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan أدوات فلاش</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco عالي الجلوكوز s النسر المتوسط المعدل</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4.5 جم / لتر جلوكوز ، L-الجلوتامين ، بدون مصل الأبقار الجنيني بيروفات الصوديوم</td></tr><tr><td></td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة فحص BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>طبق زراعة الخلايا 10 سم</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

ca المتقدرية2 + الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و ca2 +--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

إنتاج ATP من الفسفرة هي المهمة الرئيسية الميتوكوندريا. الميتوكوندريا في حقيقيات النوى أعلى أيضا المشاركة في سيتوسوليك Ca2 + التخزين المؤقت، وإنتاج ATP في الميتوكوندريا يمكن أن توسط إينتراميتوتشوندريال Ca2 + تركيز مجاناً. يمكن اعتبار Ca2 + الاحتفاظ بقدرة قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم في مصفوفة المتقدرية. ووصف المتراكمة داخل الخلايا Ca2 + يؤدي إلى نفاذية غشاء الميتوكوندريا الداخلية، افتتاح نفاذية المتقدرية الانتقال المسامية (mPTP)، مما يؤدي إلى تسرب جزيئات مع الجزيئية وزن أقل من 1.5 كاتشين. Ca2 +--تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. هنا، يمكننا وصف فحوصات اثنين لدراسة Ca2 + الاحتفاظ بالقدرات و Ca2 +-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة. بعد كميات معينة من Ca2 + يتم إضافتها، يمكن الانتهاء في يوم واحد جميع الخطوات ومسجل من قبل قارئ ميكروسكوبية. وهكذا، يمكن اعتماد هذه اثنين من فحوصات بسيطة وفعالة لتقييم Ca2 +-المتقدرية المهام ذات الصلة.

النتائج ممثلة Ca2 + الاحتفاظ بالقدرة على: وأعرب عن النتائج كقيم الأسفار. مع البقول إضافية من Ca2 + (بروتين نمولس/mg 200 mitochondrial) الأسفار زيادة مزدوجة فوق خط الأساس مع افتتاح مبتب. 5 ميكرومترات بونجكريكاتي (BKA)، المانع من Ca2 +-الناجم عن فتح مبتب، أو أتراكتيلوسيدي 1 ميكرومتر (ATR)، منشط من Ca2 +-الناجم عن فتح مبتب، وأضيفت في الميتوكوندريا المعزولة. المبلغ الإجمالي المضافة Ca2 + حتى افتتاح mPTP أشارت إلى زيادة مزدوجة ...

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف طريقة لفحص Ca2 + الاحتفاظ بالقدرات و Ca2 +--أثارت الخلايا المتقدرية تورم في الميتوكوندريا المعزولة من ش SY5Y خطوة بخطوة.

Ca المتقدرية2 + الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca2 +--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد سعة احتجاز الكالسيوم في الميتوكوندريا أثناء التورم الميتوكوندري المستحث بالكالسيوم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في دراسة الخلل الوظيفي للميتوكوندريا، مثل اضطراب عملية التمثيل الغذائي للطاقة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها بسيطة وفعالة للغاية.للبدء، قم بزراعة حوالي ثلاثة ملايين من خلايا SH-SY5Y في كل طبق زراعة خلايا مقاس 10 سنتيمتر. قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا بنحو 1 mL من PBS البارد جداً في طبق زراعة الخلايا مقاس 10 سنتيمتر ثلاث مرات. أضف 1 mL من PBS البارد جداً إلى طبق زراعة الخلايا مقاس 10 سنتيمتر وقم بكشط الخلايا الملتصقة ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.قم بالطرد المركزي عند 800 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. وأثناء عملية الطرد المركزي، قم بتحضير 5 mL من منظم عزل الميتوكوندريا، مضافاً إليه 50 µL من المحلول المخزون لمثبط البروتياز. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب باستخدام 1 mL من منظم عزل الميتوكوندريا.يُحضن الأنبوب سعة 1.5 milliliter على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يتم تحلل الخلايا العالقة باستخدام مجانس زجاجي، وذلك بتحريكه يدويًا للأعلى والأسفل على الثلج. ثم يُنقل المتجانس إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter.بعد ذلك، يتم إجراء الطرد المركزي عند 1,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لإزالة الحطام. وعقب عملية الطرد المركزي، يُنقل الراشح إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر قبل تكرار عملية الطرد المركزي كما سبق. وبعد نقل الراشح إلى أنبوب جديد، يتم إجراء الطرد المركزي عند 14,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الراسب المحتوي على الميتوكوندريا باستخدام 1 milliliter من منظم عزل الميتوكوندريا. ثم قم بطرد المحلول مركزياً لمدة 15 minutes عند 14,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لترسيب الميتوكوندريا. يجب حفظ راسب الميتوكوندريا الناتج على الثلج وإعادة تعليقه في 50 إلى 100 µL من وسط كلوريد البوتاسيوم، وذلك وفقاً لحجم الراسب قبل إجراء أي مقايسة.أخيرًا، استخدم 5 µL من المحلول الميتوكوندري لقياس تركيز بروتين الميتوكوندريا بواسطة مقايسة BCA القياسية، مع قياس OD562 باستخدام قارئ الأطباق. قم بتحضير وسط كلوريد البوتاسيوم وأضف صبغة calcium binding green الفلورية بتركيز نهائي قدره 0.5 µM قبل بدء التجربة. ولتحديد سعة احتفاظ الميتوكوندريا بالكالسيوم، قم أولاً بنقل 1 mL من الميتوكوندريا المعزولة في وسط كلوريد البوتاسيوم الذي يحتوي على 0.5 µM من صبغة calcium binding green الفلورية إلى كل بئر من آبار طبق سداسي الفجوات.يتم تحضين الميتوكوندريا وصبغة الفلورسنت الخضراء الرابطة للكالسيوم في طبق سداسي الآبار في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء المحيط لمدة دقيقة واحدة. وبعد التحضين، تُضاف أجزاء مقدارها 4 µL من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 20 mM إلى كل بئر في الطبق سداسي الآبار باستخدام إعداد التوزيع التلقائي لإدخال 200 nM من الكالسيوم لكل mg من بروتين الميتوكوندريا. يُستخدم مقياس الطيف الفلوري لمراقبة تغيرات الفلورسنت كل ثلاث ثوانٍ لمدة دقيقتين، بطول موجي للإثارة يبلغ 506 nm وطول موجي للانبعاث يبلغ 531 nm.يتم تجهيز اللوحة بالرج بسرعة 600 rpm لمدة ثلاث ثوانٍ بين القراءات، ويتم التحكم في ذلك عن طريق البرنامج. أضف كمية إضافية قدرها 4 µL من محلول كلوريد الكالسيوم بتركيز 20 mM إلى كل بئر، ثم راقب تغيرات الفلورة كل ثلاث ثوانٍ لمدة دقيقتين. ولتحديد تورم الميتوكوندريا المستحث بالكالسيوم، انقل 1 mL من الميتوكوندريا المعزولة في وسط كلوريد البوتاسيوم إلى كل بئر من أطباق الستة آبار.بعد ذلك، أضف 10 µL من محلول كلوريد الكالسيوم المائي بتركيز 20 mM إلى بروتين الميتوكوندريا لتحفيز انتفاخ الميتوكوندريا. وباستخدام قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) الذي يتم التحكم فيه بواسطة برنامج، قم بتسجيل الانخفاض في الامتصاصية كل ثلاث ثوانٍ لمدة 10 دقائق عند 540 nm. تظهر هنا النتائج التمثيلية لسعة احتجاز الكالسيوم في الميتوكوندريا لكل من bongkrekic، وهو مثبط لفتح مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا المحفزة بالكالسيوم (MPTP)، وatractyloside، وهو منشط لفتح MPTP المحفزة بالكالسيوم، بالإضافة إلى ضابط فارغ (blank control).تعد السعة في مجموعة المعالجة بـ bongkrekic أعلى بكثير من مجموعة atractyloside، كما كان متوقعاً. تظهر هنا النتائج الممثلة لانتفاخ الميتوكوندريا المستحث بالكالسيوم في مجموعات bongkrekic وatractyloside ومجموعة التحكم بدون معالجة. ويشير انخفاض الامتصاصية الذي تم رصده عند 540 nanometers إلى حدوث انتفاخ الميتوكوندريا.تشير النتائج إلى أن BKA يمكن أن يثبط فتح MPTP، بينما يمكن لـ ATR أن يسهل فتح MPTP. بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون خمس ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر الاحتفاظ بجميع المحاليل على الثلج.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam - طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم...

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

يصف هذا الفيديو فحصا قائما على قارئ اللوحة لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة. يحلل الاختبار إشارة التألق لصبغة فلورية حساسة للكالسيوم لدراسة حركية امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا والحمل الزائد للكالسيوم.

فحص امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا: طريقة قائمة على قارئ الألواح لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا المعزولة

يصف هذا الفيديو مقايسة قائمة على التصوير المجهري متحد البؤر لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا المستزرعة. يستخدم الاختبار صبغة الفلورسنت الحساسة للكالسيوم Rhod-2 / AM لقياس كالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا المستنبتة المنفذة.

مقايسة تدفق الكالسيوم لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا المستنبتة

يوضح هذا الفيديو إجراء تقييم قدرة احتباس الكالسيوم في الميتوكوندريا من خلال مراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في التألق مع امتصاص الميتوكوندريا للكالسيوم. هذا الاختبار مفيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا والعمليات المتعلقة بالكالسيوم ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج والأمراض التنكسية العصبية.

تحديد قدرة الميتوكوندريا المعزولة على الاحتفاظ بالكالسيوم

يمكن الميتوكوندريا الاستفادة من إمكانات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (Δ Ψm) لعزل الكالسيوم (الكالسيوم 2+)، مما يتيح لهم تشكيل الكالسيوم عصاري خلوي 2+ يشير داخل الخلية. نحن تصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص وΔΨ م في الخلايا الحية باستخدام الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر.

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

نقدم هنا، بروتوكولين لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. الميتوكوندريا المعزولة، ونحن بالتفصيل لوحة المستندة إلى القارئ Ca2 + استيراد الفحص باستخدام Ca2 + حساسة صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. للخلايا المستزرعة، يصف لنا طريقة الفحص المجهري [كنفوكل] استخدام Ca2 + صبغ Rhod-2/م.

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكول معدل لاختبار تدفق الركيزة التنفسية الميتوكوندريا باستخدام perfringolysin O المؤتلف في تركيبة مع قياس التنفس القائم على الصفائح الدقيقة. مع هذا البروتوكول، نظهر كيف يؤثر الميتفورمين على تنفس الميتوكوندريا لخطين مختلفين للخلايا السرطانية.

قياس تدفق الركيزة الميتوكوندريا في الخلايا المتالفة Perfringolysin O-Permeabilized

يهدف هذا proctocol إلى توفير طريقة للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.

تصوير الميتوكوندريا Ca2 + امتصاص في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام ترميز وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs)

يصف هذا البروتوكول فحصا مقارنا ، باستخدام أنشطة الميتوكوندريا المعقدة CI + CIII و CII + CIII في وجود أو عدم وجود Na + ، لدراسة وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.

تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا

هنا ، نقدم مجموعة من المقايسات لقياس وظيفة الميتوكوندريا مباشرة في خلايا الثدييات بشكل مستقل عن قدرتها على استهلاك الأكسجين الجزيئي.

المقايسات المستقلة عن الأكسجين لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الثدييات

تعلم قياس احتفاظ المتقدرات بالكالسيوم وتورمها المُحفز بالكالسيوم في خلايا SH-SY5Y العصبية. يوفر هذا البروتوكول البسيط رؤى حول وظائف المتقدرات وآليات الخلل الأيضي.

Ca المتقدرية^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca^{2 +}--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

استكشف المزيد من الفيديوهات