يعيش-تصوير الثدي الخلايا الظهارية الهجرة بعد استنفاد عابر TIP60

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة آثار استنفاد جينات معينة ذات أهمية على هجرة الخلايا. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في ورم خبيث للسرطان ، مثل هجرة الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بمراقبة هجرة الخلايا الديناميكية في الوقت الفعلي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة ، عندما كنا نلاحظ تغيرات مورفولوجيا الخلايا على مريض TIP60 ، مثبط الورم. ابدأ بزرع مليون خلية ظهارية للثدي في ثلاثة ملليلتر من وسط الاستزراع لكل طبق 10 سم. أضف 20 دقيقة من خليط SRINA المحتضن بدرجة حرارة الغرفة قطرة قطرة إلى زراعة الخلايا التجريبية.

رج كلا الطبقين يدويا للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي قبل وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد ست ساعات ، استبدل المواد الطافية بثمانية ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج لكل طبق وأعد المزارع إلى الحاضنة. في صباح اليوم التالي ، استبدل المواد الطافية بثلاثة ملليلتر من وسط المزرعة الطازجة لكل طبق وأضف رقعة ثانية من خليط SIRNA إلى مزرعة الخلايا التجريبية ، كما هو موضح للتو ، مع رج الطبق لضمان خلط الكواشف بالكامل قبل إعادة الخلايا إلى الحاضنة.

ثم استبدل المواد الطافية بثمانية ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج بعد ست ساعات واحتضان الثقافات طوال الليل. في اليوم الثالث ، اغسل الخلايا مرة واحدة بملليلترين من BPS لكل طبق وافصل الخلايا في كلا الطبقين باستخدام مليلتر واحد من EDTA ثلاثي الأبعاد لكل طبق لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، أوقف التفاعل بأربعة ملليلتر من وسط الثقافة الكامل لكل لوحة.

أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات ونقل معلقات الخلية إلى أنابيب فردية سعة 15 ملليلترا. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من الوسط الخالي من المصل لكل أنبوب. بعد العد ، قم بتخفيف كلتا المزارعين الخلويتين إلى 600،000 خلية لكل تركيز مليلتر وأضف 500 ميكرولتر من الخلايا من كل مزرعة إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئر لضمان التقاء 100٪.

عندما يتم زرع جميع الخلايا ، قم بهز اللوحة برفق ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لضمان التوزيع المتساوي وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة. للتحقق من كفاءة الضرب للجين محل الاهتمام ، اجمع الخلايا المتبقية في أنابيب التجميع باستخدام طرد مركزي آخر وعزل الحمض النووي الريبي عن الكريات ، باستخدام كاشف تجاري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتقييم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. في صباح اليوم التالي ، قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء تصوير الخلايا الحية ، قم بتشغيل المجهر والتحكم في درجة الحرارة.

اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وإمداد غاز ثاني أكسيد الكربون على 5٪ عندما تصل درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية ، استخدم الفحص المجهري لتباين الطور للتأكد من أن الخلايا ملتصقة ومتصلة بالكامل بقاع الآبار. ثم استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لخدش خط مستقيم برفق عبر كامل طول مركز كل بئر وغسل جميع الآبار برفق خمس مرات بوسط خال من المصل لإزالة الخلايا المنفصلة. بعد الغسيل الأخير ، أضف ملليلتر واحد من وسط السيروم الخالي من المصل إلى كل بئر.

ضع اللوحة على مرحلة المجهر تحت هدف الطاقة 10 ووجه الضوء المنبعث إلى قطع العين بدلا من الكاميرا. اضبط التركيز يدويا لتحديد موقع كل جرح والخلايا المحيطة به. ثم أعد الضوء المنبعث مرة أخرى إلى الكاميرا واستخدم نظام مراقبة الخلايا الحية لتحديد موضع الجروح وضبط الظروف الزمنية.

قم بتصوير الخلايا لفترة التجربة المناسبة ، ثم افتح أول فيديو avi في برنامج التصوير المناسب وافتح المكون الإضافي m track j. انقر فوق علامة التبويب إضافة لإضافة مسار للخلايا المفردة واختر خلية واحدة في طرف الجبهة الغازية وخلية واحدة يمكنها الهجرة من تلقاء نفسها. تابع حركة الخلايا المختارة في الفيديو باستخدام mtrackJ لتتبع الاتجار بها.

ثم انقر فوق علامة التبويب قياس لقياس مسافة حركة الخلية وحفظ مقاطع الفيديو مع المسارات بتنسيق avi. بعد استنفاد TIP60 ، تكون الخلايا الظهارية للثدي أكثر اللحمة المتوسطة مقارنة بالخلايا المستزرعة الضابطة. في الواقع ، ينخفض تعبير TIP60 ، بالإضافة إلى التعبير عن جزيء التصاق الخلايا الظهارية ، بشكل كبير بعد علاج siTIP60.

من ناحية أخرى ، يزداد التعبير عن جينات محرك الانتقال الظهارية إلى اللحمة المتوسطة عند استنفاد TIP60. يوضح التصوير الحي لمزارع الخلايا بعد إعطاء الجرح هجرة أسرع للخلايا المعالجة ب siTIP60 ، مقارنة بثقافات siControl ، مع زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا المهاجرة التي لوحظت استجابة لاستنفاد TIP60. علاوة على ذلك ، تتحرك خلايا siControl كورقة ، بينما لوحظت حركة خلية واحدة داخل ثقافات siTIP60.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية تصوير الخلايا الحية لمراقبة التغيرات الديناميكية لهجرة الخلايا.