إعداد المستندة إلى الشيتوزان الهلاميات المائية القابلة للحقن وتطبيقه في ثقافة الخلية 3D

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إعداد هيدروجيل شيتوزان قابل للحقن لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لاستخدامه في النهاية في العلاجات العلاجية. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على سؤال في مجال هيدروجيل ذاتي الشفاء ، مثل كيفية صنع هيدروجيل ذاتي الشفاء عن طريق الغمر بالكامل وكيفية استخدامه لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. ميزتي من هذه التقنية هي, من خلال متوافق الشفاء الذاتي هيدروجيل يمكن تحضيرها بطريقة بسيطة للغاية, واستخدام ثقافة الخلايا 3D.

هذا الهيدروجيل قابل للحقن أيضا ، لذلك يمكن استخدامه كناقل للعلاج بالخلايا. الآن سيوضح لك السيد Yongsan Li كيفية صنع الهيدروجيل وكيفية القيام بزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد باستخدام هذا الهيدروجيل. يونغسان لي هو طالب الدراسات العليا لدينا في مختبرنا.

لصنع الهلاميات المائية ، قم أولا بتجميع DF PEG. في غطاء الدخان ، قم بوزن أربعة جرامات من الوزن الجزيئي 4 ، 000 PEG في قارورة مستديرة القاع ، وأضف 100 مل من التولوين. ثم ، لإذابة البوليمرات ، قم بتسخين المحلول.

بعد ذوبان جميع البوليمرات ، استخدم مبخرا لإزالة جميع المذيبات. ثم كرر عملية الخلط في التولوين وتبخيره مرتين أخريين لتحضير بوليمرات PEG الجافة. بعد ذلك ، باستخدام محرك مغناطيسي و 100 مل من DHF ، قم بإذابة البوليمرات.

ثم قم بإذابة 0.9 جرام من 4-كربوكسي بنزالديهايد في المحلول. بعد ذلك ، قم بإذابة 0.07 جرام من ثنائي ميثيل أمينوبيريميد في المحلول. أضف الآن 1.25 جرام من DCC في أنبوب تجفيف مملوء بكلوريد الكالسيوم اللامائي

الآن اترك التفاعل يتحرك في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة تقريبا. في اليوم التالي ، استخدم 500 مل من ثنائي إيثيل الأثير البارد لترسيب المواد الصلبة البيضاء ، واستخدم الترشيح الفراغي لجمع المواد الصلبة. تخلص من المذاب وجفف المواد الصلبة تحت تهوية جيدة.

بعد ذلك ، قم بإذابة المواد الصلبة البيضاء في 100 مل من THF. يجب تصفية أي مواد صلبة بيضاء غير قابلة للذوبان قبل المتابعة. الآن قم بترسيب المواد الصلبة الذائبة باستخدام ثنائي إيثيل الأثير البارد الطازج.

ثم استخدم الترشيح الفراغي لجمع المواد الصلبة واتركها تجف مرة أخرى. كرر هذه العملية مرتين إلى ثلاث مرات ، ثم ضع المواد الصلبة البيضاء في فرن تجفيف بالمكنسة الكهربائية لتجفيفها تماما. المسحوق الأبيض الناتج هو المنتج النهائي: DF PEG منتهي بالبنزالديهايد.

لتغليف الخلايا في الهيدروجيل للزراعة ، قم أولا بإذابة 0.44 جرام من DF PEG في ملليلترين من وسائط نمو الخلايا في أنبوب سعة أربعة ملليلتر. دوامة الخليط في محلول 20٪ بالوزن. بعد ذلك ، قم بتعقيم المحلول.

قم بتحميله في حقنة سعة 10 ملليلتر ، واضغط عليه من خلال مرشح 0.22 ميكرون للاحتفاظ بالبكتيريا. الآن امزج 0.165 جراما من الجليكول الشيتوزان مع أربعة ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا ، باستخدام دوامة لعمل محلول شيتوزان بنسبة 4٪ حسب الوزن. بعد ذلك ، قم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح آخر للاحتفاظ بالبكتيريا 0.22 ميكرون.

بعد ذلك ، احصد الخلايا ، مثل خلايا L929 باستخدام التربسين. اغسل الخلايا التي تم جمعها ، وأعد تعليقها في الوسائط عند 3.75 مليون خلية لكل ملليلتر. في الخطوة التالية ، يتم زرع الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.

يعد اتباع هذه الخطوات على وجه التحديد أمرا بالغ الأهمية لتحقيق النجاح. الآن امزج 0.4 مل من تعليق الخلية مع 0.4 مل من محلول الشيتوزان باستخدام دوامة. ماصة هذا الخليط في وسط طبق بتري قطره سنتيمترين ، وقم بإدخال 0.2 مل من محلول DF PEG في الطبق.

بعد ذلك ، استخدم الأنابيب اللطيفة للحث على تكوين الهيدروجيل. قم بتقييم تكوين الهيدروجيل عن طريق إمالة الطبق ومراقبة لزوجة المحلول. لاختبار قابلية حقن الخلايا المغلفة ، قم بعمل نفس المستحضر في حقنة سعة 10 ملليلتر.

ثم ، بعد تشكل الهيدروجيل ، قم بطرد الهيدروجيل ببطء من خلال إبرة قياس 48 في طبق بتري. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من وسائط الاستزراع إلى خليط خلايا الهيدروجيل في اللوحة ، وانقل اللوحة إلى حاضنة للزراعة. كل يومين ، قم بتغيير الوسائط ، مع تراكب ثقافة خلايا الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد.

لتحضير الخلايا المغلفة في الهلاميات المائية للتصوير ، اشطف أولا الهلاميات المائية بمليلتر واحد من PBS مرتين. ثم ، قم بتلطيخ الهلاميات المائية بمحلول ثنائي الأسيتات الفلوريسين ومحلول يوديد البروبيديوم. قم بتراكب 0.5 مل من كلا المحاللين على الهيدروجيل ، واحتضان الهيدروجيل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة القصيرة مع محاليل البقع ، استنشق جميع المذيبات. لاحظ الآن الهلاميات المائية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، مع الإثارة عند 488 نانومتر لعرض الخلايا الحية ، والإثارة عند 543 نانومتر لعرض الخلايا الميتة. اجمع مجموعات الصور بشرائح بحجم ميكرونتين للتحقق من صحة توزيع الخلايا في الهيدروجيل.

خلايا L929. تم تغليف خط خلية الفأر النموذجي من الألياف الزجاجية مع صلابة أنسجة بيئة في الجسم الحي تبلغ حوالي 5،600 باسكال في هيدروجيل. كانت قابليتها للحياة عالية للغاية طوال عملية الاستزراع ، وحققت كثافة خلايا ملحوظة.

بعد سبعة أيام من الثقافة في الهيدروجيل ، زاد عدد الخلايا بنسبة 200٪ يمكن للهلاميات المائية التي تم طردها إلى طبق زراعة الخلايا من خلال إبرة قياس 48 أن تلتئم ذاتيا لإصلاح هيدروجيل متكامل بعد حوالي ساعة واحدة. بعد سبعة أيام في المزرعة ، تكاثرت هذه الخلايا أيضا بشكل كبير. يمكن العثور على أدلة على أحداث انشطار الخلايا التي ظهرت فيها بعض الخلايا مقسمة إلى قسمين.

أظهر اختبار الموتى الحي قابلية عالية جدا للحياة ، مما يدل على التكاثر الناجح للخلايا في الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد بعد الحقن. كان معدل تكاثر الخلايا هذا حوالي 3/4 معدل تكاثر الخلايا غير المحقونة بعد سبعة أيام من الزراعة. لذلك ، على الرغم من أن القوة الهائلة أثناء الحقن لها تأثير سلبي قابل للقياس ، إلا أن الخلايا المحقونة كانت لا تزال متكاثرة تماما.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تعرف كيفية تحضير هيدروجيل ذاتي الشفاء وكيفية استخدام هذا الهيدروجيل لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد وكيفية توصيل الخلية باستخدام هذا الهيدروجيل. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع أفضل إجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى ، مثل الحقن في الجسم الحي للعلاج الخلوي أو توصيل الدواء.