تطبيق الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة واحدة ومزدوجة حبلا كسر إصلاح في خلايا الثدييات
سبتمبر 5, 2017
الأسفار [كنفوكل] مجهرية والليزر أدوات العرض الجزئي-التشعيع لإحداث ضرر الحمض النووي، ورصد الاستجابة للبروتينات إصلاح الحمض النووي في المجالات النووية الفرعي المحدد. هذا الأسلوب قد دفعة قوية لمعرفتنا بالكشف عن الأضرار، والإشارات، والتوظيف. هذه المخطوطة يوضح هذه التكنولوجيات لدراسة إصلاح كسر حبلا مفردة ومزدوجة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث تلف الحمض النووي في منطقة شبه نووية من الخلية باستخدام ليزر مجهري فلوري متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لإصلاح الحمض النووي مثل كيفية تجنيد البروتينات والاحتفاظ بها في مواقع تلف الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور في الوقت الفعلي للبروتين محل الاهتمام بحيث يمكن بناء ملف تعريف التوظيف والاستبقاء.
ابدأ هذا الإجراء بوضع شريحة حجرية تحتوي على الخلايا ذات الأهمية في حاضنة علوية للمرحلة يتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تسجيل حقول الصورة باستخدام مرحلة المجهر الآلي المشفرة. حدد ميزة يمكن التعرف عليها لوعاء الاستزراع مثل الحاجز بين الآبار.
اجمع صورة وسجل موقع XY. سيسمح ذلك بمحاذاة وتسجيل مواقع XY للحقول المحددة بعد إعداد العينة. بمجرد اكتمال تسجيل الصورة ، حدد حقلا للإشعاع الدقيق وركز العينة.
بالنسبة للخلايا التي تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية ، حدد المستوى البؤري مع الحد الأقصى للمقطع العرضي النووي في قناة الفلورسنت ذات الاهتمام. يعد التركيز على المقطع العرضي الأقصى للنواة أمرا بالغ الأهمية لأنه يضمن أن النقطة المحورية تتمحور حول النواة لمراقبة تجنيد البروتين محل الاهتمام لموقع الضرر المستحث. حدد ميزة واضحة داخل النواة مثل النواة وحرك المستوى البؤري لأعلى ولأسفل أثناء مراقبة هذا التغيير في المظهر.
سيقع المستوى البؤري الحقيقي في الانتقال من الضوء إلى الظلام. لتركيز العينة، حدد المستوى البؤري الذي تحتوي فيه الميزة المحددة على تباين أكثر حدة. الخطوة التالية هي تسجيل منصب مجال الاهتمام.
قم بإنشاء منطقة اهتمام مربعة ثلاثة في ثلاثة بكسل ، أو عائد استثمار ، داخل برنامج المجهر. ضع عائد الاستثمار هذا فوق نواة الخلية المراد تلفها وقم بتعيين عائد الاستثمار هذا ليكون عائد الاستثمار التالف. اجمع صورة ما قبل التلف بما في ذلك موضع عائد الاستثمار للضرر.
احصل على صورة تحتوي على مجال ساطع في قناة الإزهار للبروتين محل الاهتمام. الخلايا جاهزة الآن للإشعاع الدقيق بالليزر. في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام الليزر 405 نانومتر بقوة 100٪.
يتم التحكم في جرعة الليزر 405 نانومتر عن طريق تعديل معدل المسح وإجراء مسح واحد لعائد الاستثمار للضرر المحدد. في هذه التجربة ، استخدم ثمانية و 0.5 إطارات في الثانية للإشعاع الدقيق عند 405 نانومتر. يعد اختيار قوة الليزر المناسبة لإتلاف الخلايا أمرا بالغ الأهمية لفصل مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة.
قم بإجراء الحصول على صورة بفاصل زمني لقنوات المجال الساطع والإزهار بعد التلف. اضبط مدة وتكرار الفاصل الزمني لتحسين جمع البيانات ، والتقاط تراكم البروتين الفلوري بشكل مثالي عند عائد الاستثمار للضرر وتفكيكه على مدار التجربة الزمنية. بعد اكتمال الدورة الزمنية ، حدد مجالا جديدا من الخلايا للتلف واستمر في التشعيع الدقيق والتصوير بفاصل زمني حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا التالفة.
يوصى باستخدام 10 إلى 25 خلية لكل حالة محددة. لزيادة العدد الكلي للخلايا لتحليل التألق المناعي ، قم بإتلاف حقول إضافية داخل وعاء الاستزراع لإنشاء مسار زمني متعدد الحقول لاستجابة ما بعد التلف. سجل موقع XY لكل حقل ووقت حدوث الضرر.
يمكن إصلاح الخلايا مباشرة بعد التلف أو السماح لها بالإصلاح لفترات زمنية محددة قبل التثبيت. لبدء هذا التحليل ، افتح الصور المكتسبة في تطبيق تحليل الصور مثل NIS-Elements. لكل خلية يتم قياسها ، قم أولا بإنشاء عائد استثمار مرجعي يمثل النواة.
استخدم خوارزمية العتبة على إشارة الإزهار التي تحتوي على وحدات البكسل التي تشكل النواة ، ثم قم بتحويل هذه المنطقة إلى عائد استثمار. بعد ذلك ، قم بإنشاء عائد استثمار ستة × ستة بكسل وضعه فوق عائد استثمار الضرر. عائد الاستثمار الأكبر هذا هو الآن عائد استثمار الضرر للتحليل.
لكل خلية يتم قياسها ، سجل متوسط شدة الإزهار للمرجع وعائد الاستثمار للضرر. لكل إطار من المسار الزمني ، اضبط عائد الاستثمار المرجعي لضمان تغطية المنطقة النووية بدقة بعائد الاستثمار وضبط عائد الاستثمار للضرر لضمان تغطية البقعة التالفة. سجل متوسط شدة التألق لإشارة الفلورسنت داخل كل عائد استثمار لكل إطار من المسار الزمني.
لكل خلية ، قم بتطبيع متوسط شدة مضان عائد الاستثمار للضرر إلى متوسط عائد الاستثمار المرجعي المقابل له في كل إطار من الفاصل الزمني. هنا ، يتم استخدام متوسط شدة التألق النووي كعائد استثمار مرجعي ويتم إجراء التطبيع عن طريق طرح متوسط شدة مضان عائد الاستثمار المرجعي من متوسط شدة مضان عائد الاستثمار للضرر. كرر التطبيع لجميع الخلايا التالفة وكذلك لخليتين تحكمتين غير تالفيتين على الأقل.
أخيرا ، قام الرسم البياني بتطبيع قيم الشدة بمرور الوقت لإظهار التغييرات في ديناميكيات التجنيد كدالة للمعالجة التجريبية. تم تشعيع الخلايا التي تعبر بثبات عن XRCC1-GFP وتصويرها قبل وبعد تحريض الضرر. لوحظ تجنيد XRCC1-GFP للضرر الذي تم قياس عائد الاستثمار وقياس ديناميكيات التوظيف.
تم فحص تكوين فواصل مزدوجة الخيط باستخدام علامتين. بالنسبة لكلتا العلامتين ، فإن التحفيز بجرعة منخفضة من الثانية عند 355 نانومتر لا يثير أي استجابة في خمس دقائق و 20 دقيقة واستجابة ضعيفة ومتغيرة بعد 10 دقائق من التشعيع. يؤدي التشعيع الدقيق ذو الجرعة العالية لمدة 10 ثوان عند 355 نانومتر إلى زيادة إشارة الفلورسنت ضمن عائد الاستثمار للضرر عند خمس و 10 و 20 دقيقة بعد التشعيع والتي يتم تقليلها في 40 دقيقة.
تشير هذه النتائج إلى أن علامات كسر الحمض النووي المزدوجة تستجيب عند تشعيع دقيق 355 نانومتر بطريقة تعتمد على الجرعة. في المقابل ، أدى التحفيز بالليزر 405 نانومتر إلى تراكم كبير لكلتا العلامتين ضمن عائد الاستثمار للضرر بغض النظر عن الجرعة المطبقة. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي أربع ساعات ل 10 خلايا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء تنفيذ هذه التقنية ، من المهم تخصيص الطول الموجي لليزر والطاقة المطبقة لعملية الإصلاح التي تتم مراقبتها. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء التألق المناعي للإجابة على أسئلة حول تجنيد بروتينات إضافية أو تغييرات في حالة الفسفرة أو غيرها من التعديلات بعد الترجمة. تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف التوظيف الديناميكي لبروتينات إصلاح الحمض النووي وتحديد كيفية تأثير مجالات الطفرات والبروتين بشكل أفضل على التعرف على تلف الحمض النووي والاستجابة له.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام المجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر للحث على تلف الحمض النووي ومراقبة تجنيد بروتينات إصلاح الحمض النووي. لا تنس أن العمل مع الليزر والمواد الكيميائية مثل الفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة الفحص المجهري الفلوري المجسم والإشعاع المجهري بالليزر لإحداث تلف في الحمض النووي ومراقبة تجنيد بروتينات إصلاح الحمض النووي في الوقت الفعلي. تعمل التقنيات على تعزيز فهمنا لآليات اكتشاف تلف الحمض النووي وإصلاحه.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- آليات إصلاح الحمض النووي
الخلفية
- تلف الحمض النووي هو عامل حاسم في وظيفة الخلية وسلامتها.
- فهم ديناميكيات بروتينات إصلاح الحمض النووي ضروري للحصول على رؤى حول استقرار الجينوم.
- يتيح الفحص المجهري المجسم التصوير الدقيق للعمليات الخلوية.
- يوفر الإشعاع المجهري بالليزر طريقة لإحداث تلف محلي في الحمض النووي.
هدف الدراسة
- للتحقيق في تجنيد وبروتينات إصلاح الحمض النووي والاحتفاظ بها في مواقع تلف الحمض النووي المستحث.
- لتحليل ديناميكيات استجابة البروتينات بمرور الوقت بعد تلف الحمض النووي.
- لمقارنة تأثيرات أطوال موجات الليزر المختلفة على مسارات إصلاح الحمض النووي.
الطرق المستخدمة
- تزرع الخلايا في شرائح مجوفة وتحتفظ بها في بيئة خاضعة للرقابة.
- يتم استخدام الفحص المجهري المجسم لتسجيل حقول الصور والتركيز على النوى.
- يتم إجراء الإشعاع المجهري بالليزر باستخدام ليزر 405 نانومتر لإحداث تلف في الحمض النووي.
- التقاط الصور بفاصل زمني يلتقط تجنيد البروتينات الموسومة بالفلورسنت بعد التلف.
النتائج الرئيسية
- تم ملاحظة وتقييم تجنيد XRCC1-GFP إلى مواقع التلف.
- أدت جرعات الليزر المختلفة إلى استجابات متفاوتة في علامات إصلاح الحمض النووي.
- كشفت التصوير بفاصل زمني عن ديناميكيات تراكم البروتينات وتفككها.
- أظهرت النتائج استجابة جرعة لعلامات إصلاح الحمض النووي للإشعاع المجهري.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة بنجاح استخدام الفحص المجهري المجسم والإشعاع المجهري بالليزر في أبحاث إصلاح الحمض النووي.
- توفر الرؤية في الوقت الفعلي رؤى قيمة حول ديناميكيات تجنيد بروتينات الإصلاح.
- يمكن تطبيق هذه التقنيات لمزيد من التحقيق في آليات إصلاح الحمض النووي في سياقات مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Laser micro-irradiation combined with confocal microscopy enables precise induction and quantification of DNA strand breaks in mammalian cells, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides real-time, quantitative insights into DNA repair protein recruitment and retention, informing target validation and pathway interrogation. The method enhances predictive confidence for DNA repair targets and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment dynamics.
- Supports functional validation of DNA repair targets by quantifying recruitment and retention at damage sites.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing single- and double-strand break responses.
- Provides quantitative data for triaging DNA repair targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, dose-controlled DNA damage induction for assay standardization.
- Generates quantitative, time-resolved readouts of protein recruitment for screening readiness.
- Supports development of scalable assays for compound evaluation targeting DNA repair pathways.
- Enables platform reuse across different repair proteins and cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair dynamics with disease-relevant cellular contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in mammalian systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying repair kinetics and pathway engagement.
- Facilitates evaluation of protein domain mutations and post-translational modifications in repair processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for DNA repair targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of DNA repair mechanisms and protein function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers time-resolved, normalized fluorescence measurements for comparative analysis of repair dynamics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling mechanistic evaluation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse DNA repair research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DNA repair target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of DNA damage and repair assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of DNA repair targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to laser-equipped confocal microscopes and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of laser dose, ROI selection, and normalization protocols.
- Adaptable to various cell models and repair proteins with appropriate optimization.
- Safety precautions are essential due to laser use and chemical fixation steps.
![تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55999.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.112Z&w=384&q=75)
