في فيفو تتبع البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة في نموذج الفئران هشاشة العظام ركبة مع صبغ الغشاء محبتين نيون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم فعالية ثبات الخلية والتوزيع الحيوي للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية في هشاشة العظام في ركبة الفئران ، أو نموذج KOA ، باستخدام التصوير الفلوري في الجسم الحي. يمكن أن يساعد تتبع الخلايا الجذعية في الجسم الحي في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال الرياضيات التجديدية حول تهيج وتوزيع الدهون البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة في نماذج KOA. الميزة الرئيسية لاستخدام DiD هي أن طيف الانبعاث المتحول للفئران يسمح بتصوير الأنسجة العميقة في الحية بدون تأثيرات خلوية أو تلف وظيفي للخلايا ذات العلامات الصبغية.

ابدأ بوضع فأر مخدر من 250 إلى 300 جرام ، يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعا من ذكر Sprague Dawley في الوضع الجانبي الأيسر على وسادة ساخنة. استخدم ماكينة حلاقة لحلق الركبة اليمنى جيدا ، وتطهير المنطقة الجراحية بمحلول اليود 10٪ بوفيدون و 70٪ إيثانول. قم بتغطية المنطقة غير الجراحية بلوحة جراحية.

واستخدم مشرطا لعمل شق بطول سنتيمترين بشكل جانبي على طول الوتر الرضفي لكشف كبسولات المفصل. بعد ذلك ، استخدم مشرطا جراحيا لتمرير الرباط الجانبي الإنسي ، مما يعكس الغضروف المفصلي باتجاه عظم الفخذ ، وأمسك الغضروف المفصلي الإنسي بالملقط. استخدم مشرطا لقطع الغضروف المفصلي في أضيق نقطة له من التعلق الظنبوب.

للحصول على بداية KOA موثوقة ومجدية ، يجب قطع جانب عظم الفخذ من الغضروف المفصلي بالكامل في كل تجريبي. بعد ذلك ، أغلق كبسولة المفصل بخياطة أربعة O يمكن ملاحظتها وراقب الجرذ حتى يتعافى تماما. بعد ثمانية أسابيع من الجراحة ، افصل الخلايا الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية عن مزرعة ملتقية بنسبة 80٪ مع ملليلترين من التربسين بالإضافة إلى EDTA لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد بضع دقائق ، قم بتحييد التربسين بأربعة ملليلتر من وسط الثقافة الكامل واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات عند مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر في خمسة ملليلتر من وسط الثقافة الخالي من المصل. وقم بتسمية الخلايا ب 50 ميكرولترا من محلول وضع العلامات على خلايا DiD لمدة 50 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي واغسلها مرتين في خمسة ملليلتر من PBS لكل غسلة. بعد آخر طرد مركزي ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2.5 في 10 إلى الخلايا السادسة القابلة للحياة لكل 100 ميكرولتر من تركيز PBS وتحميل الخلايا في حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26. بعد ذلك ، قم بإعادة حلق الركبة المصابة بالتهاب المفاصل لأول تجريبي يكشف منطقة المفصل ، وتطهير الجلد المكشوف بنسبة 70٪ من الإيثانول.

حقن الخلايا المصنفة في مركز المثلث الذي يتكون من الجانب الإنسي للرباط الرضفي ، واللقمة الفخذية الإنسية ، واللقمة الظنبوبية الإنسية ، وافتح برنامج التصوير. قم بتهيئة نظام التصوير الحيوي في الجسم الحي ووضع في وضع ضعيف داخل المرحلة المركزية من نظام التصوير. مع إغلاق باب الغرفة ، تحقق من صندوق الفلورسنت وحدد مجموعات مرشحات الفلورسنت المناسبة للإثارة والانبعاث.

اضبط مجال الرؤية على D ، وثني البكسل إلى ثمانية ، و F Stop إلى اثنين ، ووقت التعريض الضوئي إلى تلقائي. بعد الحصول على الصور ، اسمح للحيوانات بالتعافي على وسادة حرارية مع المراقبة حتى الشفاء التام. بعد ذلك ، في برنامج تحليل الصور المناسب ، حدد وحدات كفاءة الإشعاع لقياس التألق والمناطق ذات الأهمية للتحليل وتحديد إشارات الفلورسنت من كل صورة.

في هذه التجربة التمثيلية ، تم تقييم الأجزاء المتسلسلة من مفصل الركبة للفأر الناجم عن هشاشة العظام في الركبة بواسطة H & E و safranin O / Fast Green تلطيخ بعد ثمانية أسابيع من الجراحة. سمك الغضروف المفصلي أرق في الركبتين المصابتين بالتهاب المفاصل منه في المفاصل المقابلة بدون جراحة كما لوحظ في الأقسام الملطخة ب H & E. علاوة على ذلك ، يتم تقليل البروتيوغليكان وزيادة الكولاجين الليفي في مفصل التهاب المفاصل كما هو موضح من خلال تلطيخ سافرانين O / Fast Green ، مما يشير إلى تطور النمط الظاهري لهشاشة العظام في الركبة التنكسية الناجمة عن الجراحة.

بعد ساعة واحدة من التلوين ، تظهر الخلايا الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية ذات المسمى DiD شكلا دائريا في المختبر. بعد 24 ساعة ، تظهر الخلايا الوسيطة المسماة DiD المزروعة شكل مغزل طويل يؤكد أن DiD لا يغير قدرة التصاق الخلايا. يكشف تصوير ركبتي المصابة بالتهاب المفاصل بعد ثمانية أسابيع من الجراحة عن وجود خلايا مسمى DiD من اليوم صفر حتى اليوم 70 بعد الحقن.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج بالخلايا الجذعية لتحديد الروتين الأمثل والجرعة للحقن الآمن والمجدي للخلايا الجذعية الوسيطة لعلاج هشاشة العظام في الركبة في. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية ب DiD للحقن وتتبع في الجسم الحي في نموذج KOA للفئران المستحث جراحيا.