التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

الهدف العام من هذه الطريقة هو توجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات بفعالية إلى خلايا ظهارية صبغية شبكية في طبقة متجانسة. وتساعد هذه الطريقة في الإجابة على تساؤلات في مجال أبحاث الشبكية والعين، مثل كيفية تطور الشبكية وكيفية إنشاء نموذج مرض باستخدام الخلايا الجذعية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها أسرع وأكثر كفاءة من الطرق التلقائية.

تستخدم هذه الطريقة مزيجاً من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية لتصبح خلايا ظهارية صبغية شبكية (RPE) غير ناضجة خلال 14 يوماً، ثم خلايا ظهارية صبغية شبكية وظيفية ناضجة بعد ثلاثة أشهر. ستقوم كاسيدي أرنولد، المدير المساعد لمختبر بيولوجيا وهندسة الخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا، سانتا باربارا، باستعراض أجزاء من هذا الإجراء. لبدء هذا الإجراء، قم بتنمية مستعمرات الخلايا الجذعية في ظروف خالية من الخلايا المغذية وخالية من المصل حتى تصل نسبة التلاقي إلى 80% تقريباً قبل إجراء عملية النقل.

بعد ذلك، قم بطلاء طبق مكون من 12 بئراً بهيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة، واتركه ليتماسك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. بعد ذلك، قم بتقسيم الحجم المطلوب من وسط تمايز الشبكية وPBS الخالي من الكالسيوم أو المغنيسيوم واللازمين لليوم صفر، وقم بتدفئتهما في حمام مائي حتى 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف عوامل النمو إلى وسط RDM الدافئ، واجعل EDTA في درجة حرارة الغرفة.

إذا لزم الأمر، قم بإزالة جميع المستعمرات المتمايزة باستخدام رأس ماصة P10 بناءً على المورفولوجيا من الخلايا الجذعية التي سيتم تمريرها من أجل التمايز. تشير الخلايا الليفية الموجودة بين المستعمرات، وكذلك الخلايا المعتمة داخل المستعمرات، إلى الخلايا المتمايزة التي يجب إزالتها. تعد الإزالة اليدوية للخلايا إحدى أكثر الخطوات أهمية في البروتوكول، لأن البدء بمجتمع من الخلايا الجذعية غير المتمايزة تمامًا سيسمح بإثراء أكثر كفاءة.

بعد ذلك، يتم نقل محتوى بئر واحدة من طبق سداسي الآبار إلى أربعة آبار من طبق 12 بئرًا، وذلك عن طريق سحب الوسط من الخلايا الجذعية وغسل الآبار مرة واحدة باستخدام 2 mL من PBS المُدفأ مسبقًا. بعد ذلك، اسحب PBS واشطف كل بئر ثلاث مرات باستخدام 1 mL من EDTA لكل بئر. ثم قم بإمالة الطبق برفق واسحب EDTA.

تجنب رجّ الطبق بأي شكل من الأشكال لتفادي رفع الخلايا قبل الأوان. بعد الغسلة الثالثة، أضف 1 mL من EDTA مرة أخرى واحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء التدفق الصفحي لمدة تتراوح من 3 إلى 5 دقائق. لا تحرك الطبق أثناء فترة الحضن هذه.

بعد ذلك، قم بسحب EDTA وإضافة ملليلتر واحد من RDM لكل بئر سيتم التوزيع فيها، بالإضافة إلى 0.5 ملليلتر من الوسط الإضافي. على سبيل المثال، اغسل بئراً واحداً من طبق مكون من ستة آبار باستخدام 4.5 ملليلتر من RDM للتوزيع على أربعة آبار في طبق مكون من 12 بئراً. ثم استخدم كاشطة الخلايا لفصل الخلايا برفق.

قم بسحلب الخلايا في وسط RDM عن طريق السحب والضخ بالماصة خمس مرات داخل البئر، وأتمم هذه الخطوة بسرعة لمنع إعادة الالتصاق بالطبق. ضع الخلايا في أنبوب مخروطي. قم بتفكيك التكتلات الكبيرة من الخلايا ولكن لا تسحلبها حتى تصبح معلقاً من خلية واحدة.

وزع الخلايا بالتساوي في الماصة وأكمل هذه الخطوة بسرعة لمنع إعادة الالتصاق بالطبق. وإذا رغبت في ذلك، استخدم مجهراً ضوئياً لمراقبة حجم التجمعات الخلوية. بعد ذلك، ازرع الخلايا في أطباق ذات 12 بئراً مغطاة بـ ECM.

قم بإمالة الطبق ذهابًا وإيابًا لتوزيع الخلايا بالتساوي في جميع الآبار، ثم ضعه في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5%CO2 حتى موعد تغيير الوسط القادم. في هذا الإجراء، قم بطلاء طبق مكون من ستة آبار بـ ECM منخفض عامل النمو وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. اتركه ليتماسك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بتقسيم كمية DPBS المطلوبة ومليلتر واحد من RDM لكل بئر إثراء ودفئهما إلى 37 درجة Celsius في حمام مائي. اترك الإنزيم الشبيه بالتريبسين (trypsin-like enzyme) ليصل إلى درجة حرارة الغرفة ودفئ الكمية المطلوبة من وسط دعم RPE إلى 37 درجة Celsius. بعد ذلك، أضف كاشفاً مضاداً للميكروبات ومثبط ROCK إلى RSM لتحقيق تركيز نهائي قدره 0.5x من المضاد للميكروبات و10 micromolar من مثبط ROCK.

استخدم هذا الوسط خلال الأيام الأربعة إلى السبعة الأولى لتحسين الالتصاق. بعد ذلك، اشفط الوسط المستنفد من جميع الآبار وأضف 1 mL لكل بئر من وسط RDM المُدفأ مسبقاً والخالي من عوامل النمو. إذا لزم الأمر، قم بتشريح وكشط جميع الخلايا غير التابعة لـ RPE باستخدام طرف ماصة P10 تحت مجهر تشريحي.

بعد التشريح، يتم سحب RDM وجميع الحطام الخلوي وغسلها مرتين باستخدام 1 mL من DPBS المُدفأ مسبقاً لكل بئر. بعد ذلك، يُضاف 0.5 mL من TDE لكل بئر في طبق مكون من 12 بئراً ويُحضن عند 37 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تُستخدم مكشطة خلايا لإزالة الخلايا من الطبق برفق.

قم بسحق معلق إنزيم الخلايا بلطف عن طريق السحب والطرد بالماصة من ثلاث إلى أربع مرات لإنشاء معلق متجانس. بعد ذلك، خفف معلق إنزيم الخلايا بنسبة 1 إلى 10 في وسط RSM الدافئ مسبقاً والخالي من مثبط ROCK. قم بطرد معلق الخلايا مركزياً عند 173g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور خمس دقائق، قم بشفط الوسط من كتلة الخلايا وأعد تعليق الخلايا في RSM مع 10 micromolar من مثبط ROCK. بعد ذلك، قم بتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلايا من شبكة نايلون ذات مسام بحجم 40 micrometer. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) واحسب تركيز الخلايا في المحلول المصفى.

بعد ذلك، قم بزراعة الخلايا على أطباق مطلية بـ ECM ومخفضة لعامل النمو بكثافة 1×10⁵ خلية لكل سنتيمتر مربع في 4 mL من RSM يحتوي على 10 µM من مثبط ROCK. استبدل RSM المحتوي على 10 µM من مثبط ROCK بعد 48 ساعة من زراعة الخلايا، واستمر في استبدال الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. توقف عن إضافة مثبط ROCK إلى RSM بعد مرور أربعة إلى سبعة أيام.

اترك الخلايا لتنضج لمدة تتراوح من 28 إلى 35 يوماً عند 37 درجة مئوية و 5%CO2، واستمر في استبدال الـ RSM كل ثلاثة إلى أربعة أيام. تظهر هنا الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات مباشرة قبل نقلها لغرض التمايز. تكون الخلايا الجذعية صغيرة ومكتظة بكثافة داخل المستعمرات، والتي لا يبدو أنها تحتوي على خلايا متمايزة، مثل الخلايا الليفية، بين المستعمرات أو ممرات معتمة داخلها.

إليك خلايا RPE غير الناضجة في اليوم الثاني. يجب أن تظل الخلايا في هذه المرحلة دون التقاء كامل (subconfluent) مع تمدد الاستطالات في المساحات الفارغة بين الخلايا. تكون هذه الخلايا قبل عملية الانتقاء لإزالة الإثراء في اليوم 14.

تظهر الخلايا غير الظهارية الصباغية للشبكية (Non-RPE) على شكل بقع أو أشرطة معتمة. تحتوي البقعة المستديرة على خلايا ذات مورفولوجيا ليفية، بينما يُعتقد أن البقع المعتمة تمثل الشبكية العصبية. تُظهر هذه الصور خلايا RPE في الممرات صفر وواحد وثلاثة في اليوم 30.

عند كل عملية نقل، يجب أن تكون الخلايا متلاصقة (confluent) وتظهر عليها السمات المميزة لمورفولوجيا الظهارة الصبغية الشبكية، بما في ذلك الحدود الساطعة في مجهر التباين الطوري والشكل المضلع. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تقنيات النقل والإثراء في غضون ساعة إلى ساعتين حسب حجم المزرعة الخلوية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام تقنيات مثل قياس كمية الجينات أو البروتينات والمقايسات الوظيفية للإجابة على تساؤلات حول قدرة خلايا RPE على إفراز عوامل النمو أو بلعمة القطع الخارجية.

تفصل الأوراق البحثية التي نشرها Dave Buchholz في عام 2013 وLindsay Leach في عام 2015 تطوير هذه الطريقة وتحسينها. لقد قدمنا توضيحاً مفصلاً وشاملاً لكل خطوة في الإجراء لجعلها متاحة بسهولة للباحثين في هذا المجال. نتمنى لكم تجارب ناجحة.