التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

الهدف العام من هذه الطريقة هو توجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات بشكل فعال إلى خلايا ظهارية صبغية الشبكية في طبقة متجانسة. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة في مجال أبحاث الشبكية والعين، مثل كيفية تطور الشبكية وكيفية إنشاء نموذج لمرض الخلايا الجذعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أسرع وأكثر كفاءة من الطرق التلقائية.

تستخدم هذه الطريقة مزيجا من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية لتصبح RPE غير ناضجة في 14 يوما و RPE وظيفية ناضجة بعد ثلاثة أشهر. سيوضح كاسيدي أرنولد ، المدير المساعد لمختبر بيولوجيا الخلايا الجذعية وهندستها في جامعة كاليفورنيا في سانتا باربرا. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة مستعمرات الخلايا الجذعية في ظروف خالية من المغذيات وخالية من المصل إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء قبل المرور.

ثم قم بتغطية صفيحة مكونة من 12 بئرا بهيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة واتركها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتقسيم حجم وسائط تمايز الشبكية و PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم اللازم لليوم صفر وقم بتسخينها في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف عوامل النمو إلى RDM الدافئ وقم بإحضار EDTA إلى درجة حرارة الغرفة.

إذا لزم الأمر ، قم بإزالة جميع المستعمرات المتمايزة باستخدام طرف ماصة P10 بناء على التشكل من الخلايا الجذعية التي سيتم تمريرها للتمايز. تشير الخلايا الليفية بين المستعمرات وكذلك الخلايا غير الشفافة داخل المستعمرات إلى الخلايا المتمايزة التي يجب إزالتها. تعد الإزالة اليدوية للخلايا واحدة من أهم خطوات البروتوكول لأن البدء بمجموعة من الخلايا الجذعية غير المتمايزة تماما سيسمح بإثراء أكثر كفاءة.

بعد ذلك ، قم بتمرير بئر واحد من صفيحة مكونة من ستة آبار إلى أربعة آبار من صفيحة مكونة من 12 بئرا عن طريق شفط الوسط من الخلايا الجذعية وغسل الآبار مرة واحدة باستخدام ملليلترين من PBS الدافئ مسبقا. بعد ذلك ، استنشق PBS واشطف كل بئر ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من EDTA لكل بئر. ثم قم بإمالة اللوحة برفق واستنشاق EDTA.

لا تقم بتقليب اللوحة بأي شكل من الأشكال لتجنب رفع الخلايا قبل الأوان. بعد الغسيل الثالث ، أضف ملليلترا واحدا من EDTA مرة أخرى واحتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة في الغطاء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. لا تزعج اللوحة أثناء هذه الحضانة.

بعد ذلك ، قم بشفط EDTA وأضف ملليلتر واحد من RDM لكل بئر سيتم وضعه بالإضافة إلى 0.5 مل من الوسط الإضافي. على سبيل المثال ، اغسل بئرا واحدا من صفيحة مكونة من ستة آبار مع 4.5 مل من RDM لصفيحة على أربعة آبار من صفيحة 12 بئرا. ثم استخدم مكشطة الخلية لفصل الخلايا برفق.

قم بعمل ثلاثية الخلايا في RDM عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات في البئر وأكمل هذه الخطوة بسرعة لمنع إعادة التعلق باللوحة. ضعها في أنبوب مخروطي الشكل. قم بفصل كتل كبيرة من الخلايا ولكن لا تتحول إلى معلق أحادي الخلية.

وزع الخلايا بالتساوي في الماصة وأكمل هذه الخطوة بسرعة لمنع إعادة التصاق باللوحة. إذا رغبت في ذلك ، استخدم مجهرا ضوئيا لمراقبة حجم كتل الخلايا. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا على ألواح 12 بئرا مطلية ب ECM.

قم بإمالة اللوحة ذهابا وإيابا لتوزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء الآبار وضعها في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى التغيير المتوسط التالي. في هذا الإجراء ، قم بتغطية صفيحة من ستة آبار مع عامل نمو منخفض ECM وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. اتركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بتقسيم كمية DPBS المطلوبة ومليلتر واحد من RDM لكل بئر من التخصيب وقم بتسخينها إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. قم بإحضار الإنزيم الشبيه بالتربسين إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتسخين الكمية المطلوبة من RPE الداعم للوسط إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف كاشفا مضادا للميكروبات ومثبط ROCK إلى RSM لتحقيق تركيز نهائي من 0.5x مضاد للميكروبات و 10 ميكرومولار ROCK مثبط.

استخدم هذه الوسيلة خلال الأيام الأربعة إلى السبعة الأولى لتحسين التعلق. بعد ذلك ، قم بشفط الوسط المستهلك من جميع الآبار وأضف ملليلتر واحد لكل بئر من RDM الدافئ مسبقا بدون عوامل نمو. إذا لزم الأمر، قم بتشريح وكشط جميع الخلايا غير RPE باستخدام طرف ماصة P10 تحت مجهر تشريح.

بعد التشريح ، قم بشفط RDM وجميع بقايا الخلية واغسلها مرتين بمليلتر واحد من DPBS الدافئ مسبقا لكل بئر. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من TDE لكل بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، استخدم مكشطة خلية لإزالة الخلايا برفق من اللوحة.

قم بترتيورث تعليق إنزيم الخلية برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث إلى أربع مرات لإنشاء تعليق موحد. بعد ذلك ، قم بتخفيف معلق إنزيم الخلية بنسبة واحد إلى 10 في RSM الدافئ مسبقا بدون مثبط ROCK. الطرد المركزي معلق الخلية عند 173 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد خمس دقائق ، قم بشفط الوسط من حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا في RSM باستخدام 10 مثبطات ميكرومولار روك. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلية شبكية من النايلون بمسام 40 ميكرومتر. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم واحسب تركيز الخلايا في المحلول المتوتر.

بعد ذلك ، تم تقليل الخلايا الموجودة على عامل النمو ، والصفائح المطلية ب ECM في وقت واحد 10 إلى خمس خلايا لكل سنتيمتر مربع في أربعة ملليلتر من RSM مع 10 مثبطات ROCK ميكرومولار. استبدل RSM ب 10 مثبطات ميكرومولار ROCK بعد 48 ساعة من بذر الخلايا واستمر في استبدال الوسائط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. توقف عن إضافة مثبطات ROCK إلى RSM بعد أربعة إلى سبعة أيام.

اسمح للخلايا بالنضوج لمدة 28 إلى 35 يوما عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واستمر في استبدال RSM كل ثلاثة إلى أربعة أيام. تظهر هنا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات مباشرة قبل المرور للتمايز. الخلايا الجذعية صغيرة ومعبأة بكثافة داخل المستعمرات التي لا يبدو أنها تحتوي على خلايا متمايزة مثل الخلايا الليفية بين أو الممرات غير الشفافة داخل المستعمرات.

فيما يلي خلايا RPE غير الناضجة في اليوم الثاني. يجب أن تظل الخلايا في هذه المرحلة شبه متقاربة وتمتد الإسقاطات إلى المساحات الفارغة بين الخلايا. هذه الخلايا قبل الانتقاء لإزالة التخصيب في اليوم 14.

تظهر الخلايا غير RPE على شكل بقع أو شرائط معتمة. تحتوي الرقعة المستديرة على خلايا ذات مورفولوجيا ليفية بينما يعتقد أن البقع غير الشفافة هي شبكية عصبية. تظهر هذه الصور RPE عند الممر صفر وواحد وثلاثة في اليوم 30.

في كل ممر ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة ويبدو أنها تحتوي على السمات المميزة لمورفولوجيا الظهارة المصطبغة في الشبكية بما في ذلك حدود الطور اللامع والشكل متعدد الأضلاع. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنيات المرور والتخصيب في غضون ساعة إلى ساعتين اعتمادا على حجم زراعة الخلايا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام تقنيات مثل القياس الكمي للجينات أو البروتين والمقايسات الوظيفية للإجابة على أسئلة حول قدرة RPE على إفراز عوامل النمو أو الأجزاء الخارجية للبلعمة.

الأوراق البحثية التي نشرها ديف بوخهولز في عام 2013 وليندسي ليتش في عام 2015 توضح بالتفصيل تطوير هذه الطريقة وتحسينها. لقد قدمنا عرضا توضيحيا مفصلا وشاملا لكل خطوة في الإجراء لجعله متاحا بسهولة للباحثين في هذا المجال. تجربة سعيدة.