البناء وتقييم نموذج عظام النهايات كالفاريال مورين بالتعرض للجسيمات كوكرمو في تخفيف العقيم

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء وتقييم نموذج تحلل العظم في جمجمة الفأر عن طريق التعريض لجسيمات الكوبالت والكروم والموليبدينوم النانوية. يُعد تحلل العظم الناجم عن جسيمات التآكل سببًا رئيسيًا في الارتخاء العقيم الذي يؤدي إلى فشل تقويم المفاصل، إلا أن الآليات الكامنة وراء ذلك لا تزال غير واضحة. ونظرًا لطول فترة المتابعة والحدوث المتقطع، يصعب استكشاف نشوء الارتخاء العقيم في الحالات السريرية.

وبناءً على ذلك، هناك حاجة إلى نموذج حيواني للتآكل لإجراء مزيد من الدراسة. في مختبرنا، يعد نموذج تحلل العظم القحفي الفأري الذي تم إنشاؤه باستخدام جزيئات سبيكة الكوبالت نموذجاً فعالاً لدراسة نشأة الارتخاء العقيم. ويتم تحقيق ذلك من خلال توليد جزيئات نانوية من الكوبالت والكروم والموليبدنيوم من بدلة سبيكة الكوبالت أولاً، ثم إعادة تعليقها في محلول منظم من فوسفات الصوديوم بتركيز 15 mg/mL.

تتمثل الخطوة التالية في تحديد موضع الشق عند خط يمر بين النقطتين المتوسطتين بين العينين والأذنين، على التوالي. بعد ذلك، يتم إزالة السمحاق القحفي من قبة الجمجمة عن طريق التشريح الصدمي. تالياً، يتم أخذ 50 µL من المخزون المرجعي لجسيمات سبيكة الكوبالت النانوية وزرعها في الدرز المتوسط لقبة الجمجمة.

بعد أسبوعين من المتابعة، يتم التضحية ببعض الفئران وجمع عظام الجمجمة لتقييم عملية تحلل العظام. يظهر تحلل العظام بوضوح في الفئران التي عولجت بجزيئات سبائك الكوبالت النانوية، وذلك في كل من صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) وصور صبغ الـ H and E. يتم الحصول على سبيكة الكوبالت والكروم والموليبدينوم من طرف اصطناعي مصنوع من سبيكة الكوبالت، ثم يتم استخلاص جزيئات الكوبالت والكروم والموليبدينوم من سبيكة الكوبالت والكروم والموليبدينوم باستخدام تيار مستمر ثلاثي الأقطاب تحت تفريغ عالٍ.

من أجل قياس متوسط قطر جسيمات الكوبالت والكروم والموليبدينوم، ضع ملليجرام واحد من الجسيمات في 1.5 مللي لتر من الإيثانول اللامائي وقم بتعليقها باستخدام الرج بالموجات فوق الصوتية. ضع قطرة واحدة، حوالي 20 ميكرولتر، من المعلق على طاولة الهدف في المجهر الإلكتروني النافذ والتقط سلسلة من الصور. استخدم البرنامج المرفق لحساب متوسط القطر وتوزيع حجم الجسيمات في صور TEM.

تظهر في اللوحة اليسرى صور ممثلة بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، بينما توضح اللوحة اليمنى توزيع حجم الجسيمات النانوية لسبيكة الكوبالت والكروم والموليبدينوم التي تم حسابها بواسطة برنامجنا التجاري. يبلغ متوسط القطر حوالي 50 nanometers. قم بتعقيم الجسيمات في جهاز الأوتوكلاف لمدة 15 minutes لإزالة السموم الداخلية.

بعد ذلك، أعد تعليقها في محلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 15 mg/mL كمحلول مخزن. الخطوة التالية هي إنشاء نموذج تحلل العظم القحفي. اختر فئرانًا تبلغ من العمر ستة أسابيع وقم بتخديرها: ستة فئران لكل مجموعة.

ضع الحيوانات في الوضعية المناسبة. قم بإزالة الفراء وتطهير الجلد الموجود على الجمجمة باستخدام ethanol بتركيز 75%. ولإجراء الشق، حدد النقطتين المتوسطتين بين العينين والأذنين على التوالي، وقم بشق الجلد على طول الخط الواصل بينهما.

قم بإزالة السمحاق القحفي من القحف بعناية وبشكل كامل عن طريق التشريح بالصدمة. إذ يؤدي التشريح الدقيق للسمحاق إلى تكثيف التفاعلات بين الجزيئات في القحف. يتم إجراء الخياطة بعناية عند كلا طرفي الشق باستخدام غرز بسيطة متقطعة.

عادةً ما تكون هناك حاجة إلى ثلاث غرز لإتمام الخياطة. وفي المرحلة الأخيرة، يتم تمرير خيط الخياطة عبر الشق دون عقد، مع الإمساك بطرفي خيط الخياطة. يتم أخذ 15 µL من المحلول المخزون لجسيمات سبيكة الكوبالت النانوية وتثبيتها في الغرزة الوسطى من القحف.

اعقد الغرزة الأخيرة في الخياطة المتقطعة البسيطة. احتفظ بالفئران لمدة أسبوعين إضافيين. بعد مرور أسبوعين، يتم التضحية بالحيوان وجمع عظام الجمجمة.

قم بإزالة جميع الأنسجة الرخوة بلطف من عينات القحف باستخدام الملاقط، وثبّت الأنسجة في بارافورمالدهيد بتركيز 4% عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. ولتقييم تحلل العظم في النموذج المستحث بجزيئات الكوبالت والكروم والموليبدينوم النانوية، أجرِ تصويراً مقطعياً محوسباً ميكروياً (micro-CT) عالي الدقة قبل 24 ساعة من عملية المسح الميكروي. انقل عينات القحف من البارافورمالدهيد إلى محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS).

في يوم الفحص بالتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، يتم جمع عينات القحف من محلول ملحي منظم بالفوسفات، وتثبيتها على حامل مرتبط بالجهاز. يتم فحص القحف باستخدام جهاز micro-CT، ثم يتم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج متنوعة.

يعد صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H and E) أداة أخرى لتقييم انحلال العظم في نموذج مستحث بالجسيمات النانوية. قم بإزالة الكالسيوم من عينات القحف في محلول ملحي منظم بالفوسفات، يحتوي على 15% من حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي حمض الأسيتيك لمدة ثلاثة أسابيع عند درجة حرارة 4 °C. قم بطمر القحف منزوعة الكالسيوم في البارافين وتقطيعها إلى مقاطع بسمك 2 µm في منطقة ترسيب الجسيمات.

قم بصبغ المقاطع بصبغتي الهيماتوكسيلين والإيوزين. افحص المورفولوجيا العامة للممر باستخدام المجهر الضوئي والتقط صوراً مجهرية. فيما يلي صور ممثلة بالتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT).

تظهر صور إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لبيانات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) في اللوحة اليسرى. وتظهر صور المقاطع العرضية للفئران في مجموعة الضبط، ومجموعة العملية الوهمية، ومجموعة الفئران المعالجة بالجسيمات النانوية في اللوحة اليمنى. ويظهر تحلل العظم بوضوح في مجموعة العلاج بالجسيمات النانوية.

فيما يلي تحليل كمي لصور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) بواسطة البرمجيات الملحقة بالأجهزة. تشمل القياسات كثافة المعادن العظمية، أو حجم العظم، أو نسبة الحجم الكلي، ونسبة المسامية الكلية، وعدد التربيق، وسماكة التربيق، والتباعد أو المسافة بين التربيق. تظهر الفئران التي عولجت بجسيمات سبائك الكوبالت النانوية انخفاضاً ملحوظاً في كثافة المعادن العظمية وحجم العظم، مع ارتفاع نسبة المسامية الكلية مقارنة بالحيوانات الضابطة.

تظهر هنا صور تمثيلية لصبغة H and E لعينات جمجمة من الفئران في مجموعة التحكم، ومجموعة العملية الوهمية، والمجموعة المعالجة بالجسيمات النانوية. كما يظهر تحلل العظم بوضوح في مجموعة العلاج بالجسيمات النانوية. يتميز نموذج تحلل عظم الجمجمة لدى الفئران الذي تم إنشاؤه باستخدام جسيمات سبائك الكوبالت النانوية بمعدل نجاح عالٍ في نمذجة تحلل العظم الناجم عن جزيئات التآكل.

فيما يلي عدة عوامل رئيسية. أولاً، تعزز جسيمات سبائك الكوبالت النانوية التفاعل بين جسيمات التآكل وعظام القحف. ثانياً، يؤدي الكشف الكافي عن عظام القحف والتشريح الدقيق لسمحاق العظم إلى جعل التفاعل بين الجسيمات وعظام القحف أكثر كثافة.

ثالثاً، تجعل القياسات الكمية لفقدان العظام بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) من السهل تقييم الاختلافات في فقدان العظام بين العلاجات المختلفة، مما يوفر لنا دليلاً قوياً على انحلال العظم مقارنة بقياسات الشكل النسيجي التقليدية للعظام. ويُعد نموذج انحلال عظام الجمجمة الناتج عن التآكل والذي يتم إنشاؤه بواسطة جزيئات سبيكة الكوبالت نموذجاً مثالياً لدراسة التفاعل بين جزيئات التآكل والخلايا المختلفة في حالات الارتخاء العقيم، مثل الخلايا البلعمية، والأرومات الليفية، وخلايا تآكل العظم، وبانيات العظم.

نأمل أن يكون نموذجنا مفيداً للدراسات المتعلقة بالارتخاء العقيم في المستقبل.