وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية
أكتوبر 2, 2017
ويرد بروتوكول مبسط للقيام توصيف البيوكيميائية وهيكلية واسعة بروتين ملزمة الركازة الكربوهيدرات من العقدية الرئوية .
الهدف العام من هذا الإجراء هو التوصيف الكيميائي الحيوي والهيكلي لبروتين ربط ركيزة الكربوهيدرات من المكورات العقدية الرئوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير البيانات الرئيسية للمساعدة في الدراسات التعليمية لبروتين ربط الركيزة مثل تحديد ملامح استقرار المخزن المؤقت ، وحالات قلة القلة ، والهياكل الذرية. تتمثل مزايا هذا الإجراء في أنه يوفر بيانات يمكن أن تزيد من معدل نجاح التبلور ومحلول الهيكل لبروتينات ربط الركيزة بطريقة قوية ومباشرة.
أولا ، قم بإعداد 48 محلولا عازلة بنطاق الأس الهيدروجيني من 4.0 إلى 9.5 ، وتركيزات كلوريد الصوديوم تتراوح من صفر إلى 0.5 مولار. قم بتوزيع 40 ميكرولترا من كل محلول في طبق 96 بئرا. احصل على محلول منقى لبروتين ربط الركيزة المختار.
أضف خمسة ميكرولترات من محلول SBP إلى كل بئر بتركيز واحد إلى ملليغرامين لكل ملليلتر. ثم أضف خمسة ميكرولترات من صبغة الفلورسنت المركزة 20 مرة إلى كل بئر. امزج المحاليل عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
ختم اللوحة بغشاء لاصق شفاف. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 112 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. قم بتكوين نظام PCR في الوقت الفعلي للارتفاع من أربع إلى 99 درجة مئوية بمعدل ثلاث درجات في الدقيقة مع وقت انتظار مدته 10 ثوان.
اضبط النظام لأخذ قراءات التألق كل نصف درجة. اضبط إعداد مرشح التألق. وتعيين العينات.
قم بتشغيل التجربة وحدد حالة المخزن المؤقت بأعلى درجة حرارة انصهار. بعد ذلك ، قم بإعداد مخزن مؤقت بتركيز الأس الهيدروجيني وكلوريد الصوديوم المختار والذي يتضمن 2.5٪ من حجم الجلسرين وتركيز TCEP يبلغ 0.5 ملليمولار. قم بتمييز SBP المنقى باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية مع تشتت الضوء متعدد الزوايا.
حدد الأنواع الأكثر استقرارا المناسبة للتبلور ، واستخدم SEC التحضيري للحصول على أجزاء نقية من تلك الأنواع. إجراء اختبارات ما قبل التبلور لتحديد تركيز البروتين الأمثل للتبلور. استخدم نظاما آليا للتبلور لتوزيع حلول البلورة التجارية المرغوبة في خزانات المحلول للوحة إسقاط بصرية مكونة من 96 بئرا.
ثم استخدم النظام لتوزيع 100 نانولتر من محلول البروتين في كل قطرة تبلور جيدا. انقل 100 نانولتر من كل محلول تبلور من آبار الخزان إلى قطرات الآبار المقابلة. ختم اللوحة بغشاء لاصق بصري.
استخدم مجهريا أو نظام تصوير آليا لتقييم تكوين البلورات ونموها كل يوم إلى يومين لمدة أسبوعين ، ومرة واحدة في الأسبوع بعد ذلك. عندما تتشكل بلورات كبيرة بما فيه الكفاية وذات شكل جيد ، قم بإعداد مجموعة من محلول التبلور بحجم إضافي 25٪ من الجلسرين ليكون بمثابة مادة واقية من التبريد. بعد ذلك ، املأ ديوار الرغوة بالنيتروجين السائل.
اغمر حاوية عينة unipuck في النيتروجين السائل واترك العلبة لتبرد. ثم قم بقص الفيلم فوق قطرة تحتوي على بلورة ذات أهمية. قم بإيداع 0.5 ميكرولتر من مادة الواقي من التجوال بالتبريد على شريحة غطاء بالقرب من القطرة أو في حجرة الإسقاط الفارغة من نفس الحالة إن وجدت.
قم بتوصيل حلقة برد مثبتة على قاعدة قياسية SPINE. استخدم cryoloop لنقل البلورة ذات الأهمية إلى قطرة القوام بالتبريد. ثم استخدم cryoloop لنقل البلورة من مادة التبريد إلى الموضع الفارغ الأول لحاوية عينة unipuck المغمورة.
كرر هذه العملية لحصاد بلورات إضافية. بمجرد تحميل جميع البلورات ذات الأهمية في حاوية العينة ، استخدم عصا القرص لوضع لوحة قاعدة unipuck على العلبة. انقل unipuck في النيتروجين السائل إلى خط الحزمة.
استخدم ملقط التبريد وأداة تحميل عفريت ديوار لتحميل unipuck في مغير عينة خط الشعاع dewar وفصل حاوية العينة. ثم حدد العينة في برنامج خط الشعاع لتحميل العينة وتوسيطها تلقائيا في شعاع الأشعة السينية. الحصول على طيف فلورسنت بالأشعة السينية وتحديد أي عناصر يمكن استخدامها في تجربة حيود شاذة.
تحديد الطول الموجي الأمثل لجمع بيانات الحيود الشاذة عن طريق إجراء مسح لطاقة حافة امتصاص الأشعة السينية. ثم احصل على ثلاثة أنماط حيود للأشعة السينية على فترات 45 درجة في وضع التذبذب القياسي لتحديد معلمات خلية الوحدة البلورية والتماثل وحد الانعراج تلقائيا. استيراد معلمات جمع البيانات الموصى بها إلى برنامج خط الحزمة وإجراء تجربة حيود شاذ أحادي أو متعدد الأطوال الموجية حسب الاقتضاء.
تم تقييم استقرار بروتين ربط الركيزة SP0092 في مخازن ملح مختلفة لتحديد الحل العازل الأمثل. تم العثور على أعلى درجات حرارة انصهار للمخازن المؤقتة ذات الأس الهيدروجيني 6.5 وتركيزات كلوريد الصوديوم التي تتراوح من صفر إلى 0.2 مولار. تم اختيار مخزن مؤقت بدرجة حموضة 6.5 وتركيز كلوريد الصوديوم 0.2 مولار لهذا الإجراء.
تم تحديد حالات قلة القلة المختلفة ل SP0092 وفصلها باستخدام SEC-MALS. أشار تحليل ملف تعريف SEC بتركيزات بروتين مختلفة إلى أن زيادة تركيز البروتين يؤدي إلى قلة القلة ، مما يشير إلى أن قلة القلة الأكبر حجما تكون أكثر استقرارا عند التركيزات العالية. تمشيا مع هذا ، أنتجت القلة الكبيرة بلورات في تجارب التبلور ، في حين أن المونومر لم يفعل ذلك.
أشار تألق الأشعة السينية لكل من بلورات SP0092 الأصلية والسليلينوميثيونين إلى ارتباط الزنك بالبروتين في كلا الشكلين. تم تعظيم الإشارة الشاذة عن طريق ضبط الطول الموجي للأشعة السينية الساقطة على حواف امتصاص الأشعة السينية إما للزنك أو السيلينيوم. ثم تم الحصول على مجموعة بيانات شاذة كاملة ، وتم إنشاء التحليل الآلي الناجم عن وجود إشارة شاذة عن إنشاء خرائط أولية لهياكل البروتين.
ثم تم تحسين النماذج المضمنة في هذه الخرائط الأولية والتحقق من صحتها لإنتاج النماذج النهائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إكمال التوصيف الهيكلي الشامل لبروتين ربط الركيزة أو أي هدف بروتين محتمل. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تطوير علاجات جديدة لمرض المكورات العضلية ، لأنها توفر رؤى أساسية للتصميم القائم على الهيكل لمثبطات هذه الفئة من البروتينات.
يمكن أيضا تطبيق هذه الطرق على بروتينات ربط الركيزة من الكائنات الحية الأخرى ، ومن المحتمل أن يتم استخدامها لأي نوع من البروتينات.
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مبسطًا لتحديد الخصائص البيوكيميائية والهيكلية لبروتين ربط ركيزة الكربوهيدرات من Streptococcus pneumoniae. تهدف الطريقة إلى توفير بيانات أساسية لدراسات بروتينات ربط الركيزة، مما يعزز نجاح البلورة وحل الهيكل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- البيولوجيا الهيكلية
- توصيف البروتين
الخلفية
- تلعب بروتينات ربط ركيزة الكربوهيدرات أدوارًا حاسمة في التمثيل الغذائي البكتيري.
- فهم هيكلها يمكن أن يساعد في تصميم الأدوية والتدخلات العلاجية.
- تعتبر طرق التوصيف ضرورية لتحديد ظروف الاستقرار والبلورة.
- تركز هذه الدراسة على بروتين محدد، SP0092، من Streptococcus pneumoniae.
هدف الدراسة
- توصيف الخصائص البيوكيميائية لـ SP0092.
- تحديد ظروف المخزن الأمثل للاستقرار والبلورة.
- تقييم حالات الأوليغوميرية وتأثيرها على البلورة.
الطرق المستخدمة
- إعداد محاليل المخزن بـ pH وتركيزات ملح مختلفة.
- اختبارات استقرار تعتمد على الفلوريسنس لتحديد درجات حرارة الانصهار.
- كروماتوغرافيا الفصل بالحجم مع تشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS) لتحليل الأوليغوميرية.
- بلورات الأشعة السينية لتحديد الهيكل البلوريّ للبروتين.
النتائج الرئيسية
- تم تحديد ظروف المخزن الأمثل بـ pH 6.5 وتركيز كلوريد الصوديوم 0.2 مولار.
- أدى زيادة تركيز البروتين إلى الأوليغوميرية، مما عزز نجاح البلورة.
- أشارت فلوريسنس الأشعة السينية إلى ارتباط الزنك في كل من بلورات SP0092 الأصلية وبلورات SP0092 المرتبطة بالسيلينوميثيونين.
- قدم التحليل الآلي لبيانات الانعراج خرائط هيكل البروتين الأولية.
الخلاصات
- نجحت الدراسة في تحديد بروتوكول لتوصيف SP0092.
- يمكن أن يؤدي تحديد الظروف الأمثل إلى تحسين نتائج البلورة بشكل كبير.
- تساهم النتائج في فهم أفضل لبروتين ربط الركيزة في البكتيريا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables structure-based design of inhibitors targeting carbohydrate substrate binding proteins in Streptococcus pneumoniae, a priority for antimicrobial and vaccine development against resistant strains. By establishing optimal buffer conditions and characterizing oligomerization states, the method de-risks early-stage target validation and supports predictive confidence in downstream inhibitor screening. The approach provides a reusable framework for evaluating extracellular proteins central to pathogen metabolism, informing portfolio prioritization in antibacterial discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining buffer stability profiles and oligomerization states critical for target engagement.
- Operational Value: Provides quantitative thermal shift and SEC-MALS data to assess target homogeneity and reduce false positives in assay development.
- Predictive Value: Identifies conditions favoring crystallization-competent oligomers, increasing success rates for structure-guided inhibitor design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, homogeneous protein preparations suitable for biochemical and biophysical assay formats.
- Operational Value: Establishes standardized buffer conditions (pH 6.5, 0.2 M NaCl) ensuring reproducibility across screening campaigns.
- Scalability Value: Uses robotic crystallization and SEC-MALS platforms adaptable to medium-throughput target characterization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links structural insights to pneumococcal carbohydrate import pathways, supporting mechanism-based inhibitor design.
- Preclinical Value: Enables evaluation of inhibitor binding to zinc-bound SP0092 structures, informing selectivity and resistance profiling.
- Continuity Value: Provides a transferable method for characterizing homologous SBPs across bacterial strains, supporting broad-spectrum target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, progressing from target validation through structural characterization to enable lead identification efforts for antimicrobial programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via biochemical profiling of substrate binding and oligomerization states under physiologically relevant conditions.
- Screening: Delivers assay-ready protein samples with defined stability and monodispersity for reliable compound screening.
- Analytics: Provides SEC-MALS oligomerization data and thermal shift metrics to compare protein states and buffer effects.
- Translational Research: Connects structural data to carbohydrate transport mechanisms, informing target validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for SBP characterization applicable to multiple targets and pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validity by resolving atomic structures and ligand-binding sites.
- Operational Value: Enhances reproducibility through defined buffer conditions and automated crystallization tracking.
- Strategic Value: Reduces attrition risk by enabling early go/no-go decisions based on structural druggability assessments.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with validated structural tractability and metabolic relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, thermal shift assays, and SEC-MALS operation.
- Dependent on access to size-exclusion chromatography, multi-angle light scattering, and synchrotron beamline facilities.
- Necessitates cross-team standardization of buffer formulations and protein concentration ranges.
- Involves adaptation considerations for different SBP subclasses and oligomerization tendencies.
- Limited by the need for crystallization-competent protein states, which may require extensive condition screening.
