التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا
January 7th, 2019
يصف لنا إجراء تجريبي لقياس نشاط الخلايا العصبية من خلال النوافذ الضوئية المزدوجة أعلاه الثنائية كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في Thy1-GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا باستخدام 2-فوتون (ف 2) الفحص المجهري في فيفو.
هذه الطريقة تمكن من تسجيل و كمية النشاط العصبي عبر المناطق الماوس القشرية الثنائية لفترة طويلة في الجسم الحي. تقنية الفوتون اثنين لديه ميزة الكشف عن النشاط في وقت واحد في مجموعات الخلايا العصبية الكبيرة أو المتناثرة على مدى فترة طويلة. امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التحقيق في أنماط النشاط في مجموعات الخلايا العصبية المحددة في مناطق مختلفة من الدماغ الحي.
12 ساعة قبل بدء العملية، وساخنة النوافذ البصرية في 50 درجة مئوية في 70٪ الإيثانول. نافذة بصرية تتكون من جولة قطرها خمسة ملليمتر أعلى غطاء الزجاج والجزء السفلي تحتوي على جولة 3 ملليمتر قطر غطاء الزجاج. في نهاية الحضانة الاحترار، تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم على تخدير 20 إلى 25-غرام 1 1/2 إلى 2 1/2 الشهر Thy1 GCaMP6s الماوس، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان.
ضع الماوس على وسادة التدفئة المغطاة بستارة معقمة واستخدم محولًا ممسكًا بالرأس للفئران لتثبيت الرأس. حلاقة معظم فروة الرأس مع حلاقة مزدوجة الحافة، وتنظيف الجلد المكشوف مع منصات إعداد الكحول العقيمة متسلسلة والدعك محلول بوديوني اليود. ثم استخدام زوج من مقص لجعل مستطيلة قطعت اثنين من ثلاثة ملليمتر في فروة الرأس على الجانب الأيمن من الجمجمة.
باستخدام مسحة القطن، ودفع الجلد جانبا لخلق منطقة التعرض من أكبر من ثلاثة ملليمترات في القطر، واستخدام شفرة مجهرية حادة لإزالة بلطف النسيج الضام تعلق على الجمجمة. مع حفر الأسنان، وعلامة بلطف دائرة قطرها ثلاثة ملليمتر حول منطقة S1. بعد جعل دائرة مماثلة على الجانب الأيسر من الجمجمة، وتطبيق طبقة رقيقة من الغلوغليات سيانوكريلا على جانبي العظام لتوفير قاعدة لتطبيق أسمنت الأسنان.
تحت مجهر تشريح، واستخدام حفر الدقيقة عالية السرعة لرقيقة أسفل الأخدود الدائري في الجانب الأيمن من الجمجمة حول منطقة S1 لخلق حافة ناعمة، التطلع حطام العظام مع فراغ حسب الضرورة. بعد ما يقرب من 2/3 تم تحقيق عمق العظام، ببطء وبعناية رقيقة المتبقية 1/3 من العظام حتى تم تحرير رفرف العظام دائرية تماما من الجمجمة المحيطة بها. استخدام زوج من 5/45 ملقط لإزالة ببطء وبعناية قطعة دائرية من العظام لفضح دورا، مع الحرص على تجنب إتلاف الأوعية البزى.
بعد إزالة رفرف العظام من الجانب الأيسر من الجمجمة بنفس الطريقة ، شطف النافذة البصرية للجانب الأيمن من الجمجمة مع المالحة العقيمة ، والتحقق من العيوب تحت مجهر ستيريو. تثبيت نافذة بصرية على منطقة القحف مع الجزء العلوي من النافذة يستريح على الجمجمة والجزء السفلي داخل فتحة القحف، يستريح على دورا، في وجود السائل الشوكي الدماغي. استخدام السيلانوكريل superglue لختم الجزء العلوي من حافة النافذة البصرية إلى الجمجمة.
عندما يجف الغراء ، وتطبيق الاسمنت الأسنان السوداء على حافة الزجاج ، وبقية الجانب الأيمن من الجمجمة المكشوفة ، والهوامش الجرح لمنع الضوء. ثم تثبيت نافذة بصرية اليسار والسماح للحيوان لاسترداد مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل. بعد سبعة إلى 10 أيام من الإجراء ، ضع الحيوان المُجَدَّد في مهايئ الرأس على وسادة تدفئة تحت مجهر ذي فوتين ، مع الحرص على أن النافذة البصرية والجانب الأيمن من الجمجمة موجهان عموديًا على المحور البصري للمجهر.
الحصول على صورة خريطة مرجعية أولية من النافذة القحفية باستخدام الإضاءة في المجال الساطع في التكبير أربع مرات. بعد الحصول على صور متعددة من نفس المنطقة ذات الاهتمام، صورة ديناميات الكالسيوم داخل منطقة S1 في نصف الكرة الأيسر وحساب التغيرات في الفلوريس من كل منطقة من الاهتمام على جانبي الجمجمة. في هذه الصور التمثيلية، تم تصور التشعبات والأوعية الدموية داخل فأر التعبير عن EGFP في أعماق مختلفة في الطبقة الثانية من منطقة S1 بعد يوم واحد من تركيب النافذة البصرية.
تم التقاط صور الإسقاط Z في اليومين الأول والسابع بعد زرع النافذة البصرية ، مما يدل على عدد مستقر بشكل ملحوظ وموقع الفروع والعمود الفقري التشعبية خلال الفترة التجريبية. قياس عابر الكالسيوم داخل الخلايا في Thy1 GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا يسمح القياس الكمي لنشاط الكالسيوم العفوي والسكان من الطبقة خمس خلايا عصبية هرمية تقع في عمق أكبر من 500 ميكرومتر تحت بيا وكذلك حساب متوسط عدد الاستجابات العفوية مع مرور الوقت. وينبغي أن يكون الباحث المدربين في كل من إعداد نافذة الجمجمة وفي vivo اثنين من الفوتون تقنيات تصوير الكالسيوم تكون قادرة على الحصول على تسجيلات من 100 إلى 200 الخلايا العصبية على جانبي الجمجمة في واحد إلى اثنين في اليوم الواحد.
مع نافذة بصرية مفتوحة على كل جانب من الجمجمة ، تمكن الطريقة من تسجيل النشاط العصبي عبر مناطق الدماغ الثدييات المتماثلة لتصوير الكالسيوم لفترة طويلة ومستقرة في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة النشاط القشرية واللدونية بعد إصابة أحادية الطرفية أو الجهاز العصبي المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت النوافذ القحفية الثنائية لقياس ديناميات الكالسيوم باستخدام مجهر فوتون اثنين في Thy1 GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا.
النظرة العامة
تصف هذه المقالة طريقة لقياس النشاط العصبي في الفئران المعدلة وراثيًا Thy1-GCaMP6s باستخدام نوافذ بصرية مزدوجة وميكروسكوب ثنائي الفوتون. تتيح هذه التقنية تسجيلات طويلة الأمد في الجسم الحي للنشاط العصبي عبر القشرة الحسية الجسمية الأولية الثنائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- تصوير الأعصاب
- تصوير الكالسيوم
الخلفية
- يُمكّن ميكروسكوب ثنائي الفوتون الكشف المتزامن عن النشاط في مجموعات عصبية كبيرة.
- تطبق هذه الطريقة لدراسة أنماط النشاط في مجموعات عصبية معينة.
- تستخدم فئران Thy1-GCaMP6s لتصور ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية.
- يمكن تطبيق تقنيات التسجيل لتقييم النشاط القشري بعد الإصابات.
غرض الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لتثبيت النوافذ القحفية للتصوير في الجسم الحي.
- لتمكين قياس النشاط الكالسيوم التلقائي في الخلايا العصبية القشرية.
- تسهيل دراسة الديناميكيات العصبية في الأنسجة الدماغية الحية.
الطرق المستخدمة
- إعداد النوافذ البصرية والإجراءات الجراحية لجراحة الجمجمة.
- تركيب النوافذ البصرية فوق القشرة الحسية الجسمية الأولية.
- ميكروسكوب ثنائي الفوتون لتصوير ديناميكيات الكالسيوم.
- تحليل التغيرات في الفلورسنت لقياس النشاط العصبي.
النتائج الرئيسية
- تصوير مستقر للفروع التشعبية والتشعبات بمرور الوقت.
- القدرة على تسجيل من 100 إلى 200 خلية عصبية يوميًا.
- قياس التقلبات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية الهرمية في الطبقة الخامسة.
- طريقة قابلة للتطبيق لدراسة اللدونة القشرية بعد الإصابات.
الاستنتاجات
- تتيح طريقة النافذتين البصريتين تصوير الكالسيوم الفعال في الجسم الحي.
- تعزز هذه التقنية فهم النشاط العصبي في القشرة.
- توفر أداة قيمة للتحقيق في وظيفة الدماغ واللدونة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables prolonged, stable in vivo imaging of neural activity across symmetric brain regions, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By quantifying calcium dynamics in defined neuronal populations, it provides mechanistic de-risking for CNS-targeted therapeutics. The bilateral imaging capability enhances predictive confidence in pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring spontaneous calcium activity in layer five pyramidal neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation through stable imaging of dendritic structures over 7 days.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying intracellular calcium transients in deep cortical neurons (>500 µm).
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation via dual optical window implantation.
- Quantitative Output: Enables fluorescence change calculations from regions of interest for activity quantification.
- Scalability: Allows recording of 100–200 neurons per side per day in 1–2 animals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying cortical activity and plasticity after unilateral peripheral or central nervous system injury.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation of neuronal dynamics in living brain tissue.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by stabilizing imaging of dendritic branches and spines over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through hypothesis testing and pathway clarification in symmetric cortical regions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of neural activity in bilateral S1 regions.
- Screening: Delivers assay readiness via stable calcium imaging windows for prolonged in vivo recordings.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements to compare conditions across hemispheres.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling post-injury cortical plasticity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal neural activity monitoring across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through quantification of spontaneous calcium activity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via stabilized dendritic imaging over experimental periods.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling mechanistic de-risking of CNS targets.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via longitudinal neural activity tracking in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cranial window preparation and in vivo two-photon calcium imaging.
- Needs instrumentation for two-photon microscopy and surgical tools for bilateral craniotomy.
- Demands cross-team standardization for optical window installation and fluorescence analysis.
- Involves adaptation considerations when applying to other brain regions beyond S1.
- Limited by the need for postoperative recovery period (7–10 days) before imaging.
