في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

الهدف العام من هذه التجارب هو تقييم مستويات الانقسام في الخلايا البشرية ، C.elegans ، والفئران. أصبح Mitophagy مفهوما مهما للغاية في مفترق طرق التنكس العصبي وأمراض التمثيل الغذائي والشيخوخة ، ويمكن أن تساعد نظرة ثاقبة على المنهجيات المعروضة هنا والاستخدام المستقبلي لها في إحراز تقدم في هذا المجال المهم. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تكتشف الانقسام القلبي بطريقة قوية وفعالة وتمكن من اكتشاف الانقسام في المختبر وفي الجسم الحي.

ستساعد هذه التقنية المعروضة هنا الباحثين على تطوير رؤى جديدة وتطوير استراتيجيات جديدة للعلاج ضد الأمراض المولدة للأعصاب ، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون ، حيث نعلم أن هناك خللا وظيفيا في الميتوكوندريا. بالإضافة إلى توفير رؤى حول الآليات الجزيئية للانقسام ، قد تؤدي هذه الطريقة إلى اكتشاف الأدوية المرشحة الجديدة من خلال فحص محفزات العاثية. تعد العروض المرئية لهذه الأساليب أمرا بالغ الأهمية لأن مستويات الانقسام اللوني حساسة للغاية للتغيرات في الظروف التجريبية في كل من C.elegans والفئران.

قم بزراعة 300 ، 000 إلى مليون خلية في طبق ميكروويل ذو قاع زجاجي 35 ملم ، 10 ملم ميكروويل ، بحيث تصل الخلايا إلى 70٪ التقاء في اليوم التالي. الحفاظ على الخلايا في وسط زراعة الخلايا الكامل واحتضانها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بتخفيف 15 ميكرولترا من كاشف تعداء الحمض النووي ب 150 ميكرولترا من الوسط الخالي من المصل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

أيضا ، قم بتخفيف اثنين إلى خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي البلازميد mito-Keima مع 150 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. أضف بلازميد mito-Keima المخفف إلى كاشف تعداء الحمض النووي المخفف وقم بدوامة الخليط لمدة 10 ثوان. ثم احتضن الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف خليط كاشف تعداء الحمض النووي إلى الخلايا ، ورج الألواح برفق لمدة خمس إلى 10 ثوان لخلط المحلول. في هذه المرحلة ، ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة واحتضانها لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسائط إلى وسط زراعة خلية كامل جديد ثم احتضان الخلايا المنقولة لمدة 24 ساعة إضافية.

قم بتصوير الخلايا المنقولة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. قم بتصوير 20 منطقة بشكل عشوائي أقل من 40 مرة من أجل توثيق ما مجموعه 100 إلى 200 خلية في كل بئر. في اليوم الأول ، اختر يرقات L4 للحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن كل من DCT-1 GFP و DSRed LGG-1 في خلايا عضلة جدار الجسم وضعها على صفيحة وسائط نمو الديدان الخيطية المصنفة OP50.

ضع من خمس إلى 10 ديدان على كل صفيحة طولها 3.5 سم باستخدام ثلاث أطباق على الأقل. عند الانتهاء ، احتضن الديدان الخيطية عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، في اليوم الخامس ، قم بمزامنة الديدان الخيطية عن طريق اختيار 15 إلى 20 يرقات معدلة وراثيا L4 ونقلها إلى صفائح بذور OP50 طازجة.

استخدم ما لا يقل عن خمس لوحات لكل حالة تجريبية. في اليوم السابع ، قم بإعداد بعض لوحات السيارة للانقسام الذي يؤثر على الأدوية ذات الأهمية وبعضها لاستخدامه كعناصر تحكم إيجابية. بعد ذلك ، قم بتعريض الألواح المشبعة بالبكتريا القولونية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة بكثافة 222 ميكروواط لكل سنتيمتر مربع ، لضمان عدم استقلاب المركبات المسببة للانقسام على الصفائح بواسطة البكتيريا.

الآن ، أضف المركب محل الاهتمام في 10 ميكرولتر إلى الجزء العلوي من الألواح المصنفة وأضف كمية مكافئة من السيارة المركبة إلى لوحات السيارة كعنصر تحكم سلبي. للتحكم الإيجابي في تحريض الانقسام ، أضف الباراكوات ، وهو مادة سامة للميتوكوندريا. قم بتدوير الألواح برفق حتى يغطي المحلول السطح بالكامل ، واترك الألواح تجف مع إغلاق الأغطية ، في درجة حرارة الغرفة ، لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بمجرد أن تجف ، انقل 10 إلى 20 معدليا وراثيا بالغا يبلغ من العمر يومين إلى الأطباق. احتضنها عند 20 درجة مئوية لمدة يومين. في اليوم التاسع ، قم بإعداد 2٪ من ضمادات الاغاروز وأضف قطرة واحدة من 20 مللي مولار من الليفاميزول في M9 ، لكل وسادة.

شل حركة المعدلة وراثيا للتصوير عن طريق وضعها في قطرة الليفاميزول M9. ثم ضع برفق زلة غطاء على الجزء العلوي من القطرة. ضع العينة على مرحلة المجهر متحد البؤر وقم بتصوير خلايا عضلة جدار الجسم الفردي عن طريق التقاط صور Z-stack تحت تكبير 63 مرة.

ضع كبد فأر ميتو كيما طازج ومعزولا على صفيحة معدنية مبردة ، على الثلج ، لتبريد الأنسجة بسرعة. احتفظ بها هناك أثناء معالجة الأنسجة في أسرع وقت ممكن ، حيث تظل الإشارة من بروتين ميتو كيما مستقرة على الجليد لمدة تصل إلى ساعة واحدة. بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط المنحني لرفع عينة الكبد وشطفها بخمسة ملليلتر من PBS المثلج.

أخيرا ، قم بتصوير أقسام الأنسجة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع إثارة متتالية. باستخدام الإجراء المعروض هنا ، تم نقل خلايا HeLa البشرية باستخدام بلازميد mito-Keima. أظهرت الخلايا السليمة شبكة ميتوكوندريا جيدة التنظيم مع عدد قليل من حالات الانقسام.

ومع ذلك ، أظهرت الخلايا المعالجة مسبقا باستخدام FCCP غير المرتبط بالميتوكوندريا ، زيادة كبيرة في حدوث الانقسام. تم قياس Mitophagy أيضا باستخدام التوطين المشترك ل LAMP2 و COXII. للكشف في الجسم الحي عن الانقسام في C.elegans ، تم علاج الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التي تعبر عن MT rosella في خلايا عضلة جدار الجسم بثمانية مليمولار من الباراكوات.

تم العثور على مستوى تحريض الانقسام المشار إليه بانخفاض في نسبة التألق الحساسة للأس الهيدروجيني ، قد انخفض بشكل كبير في الديدان الخيطية المعالجة بالباراكوات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العدد المرتفع من أحداث التوطين المشترك بين DCT-1 المنصهر GPF و DSRed المنصهر LGG-1 ، يدل على تحفيز الانقسام استجابة للإجهاد التأكسدي. أخيرا ، تمثل هذه الصور إشارات ميتو كيما من الكبد والمخيخ لفأر ميتو كيما.

يجب أن تبقى الأنسجة باردة وتصويرها في أسرع وقت ممكن ، ولكن عند تحضيرها بشكل صحيح ، يمكن استخدامها لتوفير نظرة ثاقبة على الانقسام في الظروف الطبيعية والفيزيولوجية المرضية. مهد استخدام هذه التقنية الطريق للباحثين في المجال الواسع للتنكس العصبي وبيولوجيا الميتوكوندريا ، لاستكشاف وظائف الميتوكوندريا في أنظمة نموذجية مختلفة بما في ذلك الخلايا المستنبتة ، أو الديدان ، أو C.elegans ، ونماذج الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لطرق متعددة لاستخدامها في التقييم الكمي لمستويات الانقسام في كل من C.elegans والفئران.