استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو دمج بقايا السيستين في البروتينات عن طريق الطفرات الموجهة للموقع في المواقع التي تحتوي على الجليكوزيل أصلا واستخدام مناهج ربط وتقييم الجلوكوز في المختبر لتقييم الكفاءة والآثار الهيكلية للجليكوزيل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية مثل ، ما هي العواقب الهيكلية لارتباط البروتين وكيف تؤثر هذه التعديلات على الآليات الأساسية للوظيفة؟ تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها قابلة للتكيف بسهولة لدراسة أو التعامل مع الارتباط بالجليكوزيل.

إنه ذو كفاءة عالية ويمكن تقييم كل من اضطرابات الهيكل وكفاءتها بسرعة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأمراض لأن أنماط الارتباط بالجليكوزيل المتغيرة ارتبطت بالعديد من أنواع السرطان والاضطرابات التنكسية العصبية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتأثيرات البروتينات التي تحتوي على الغليكوزيلات أصلا ، إلا أنها يمكن أن توفر أيضا معلومات تشتد الحاجة إليها حول كيفية تغيير أنماط الارتباط بالجليكوزيل التي قد تساهم في هذه المجموعة من الأمراض.

لإدخال طفرة سيستين واحدة في ناقل التعبير ، قم بإعداد أنبوبين فرديين لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في الأنبوب الأول ، أضف التمهيدي المطفرات الأمامي وفي الأنبوب الثاني ، أضف التمهيدي العكسي المطفر. أضف تركيزا نهائيا من 1X PCR المؤقت إلى كلا الأنبوبين.

بعد ذلك ، قم بإعداد برنامج خمس دورات لأنبوبي تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المنفصلين. أضف وقت تمديد مدته سبع دقائق ونصف عند 72 درجة مئوية في نهاية الدورة الخامسة. بعد اكتمال الدورات الخمس ، امزج تفاعلي تفاعل البوليميراز المتسلسل المنفصلين في أنبوب واحد ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثلاث ثوان تقريبا ، وكرر 20 دورة إضافية باتباع نفس ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

بعد ذلك ، قم بتشغيل 15 ميكرولترا من العينة على هلام الاغاروز 1٪ من الحمض النووي عند 120 فولت لمدة 40 دقيقة. ثم اغمر الجل في الماء الذي يحتوي على 0.5 ملليغرام لكل مليلتر من بروميد الإيثيديوم ورجه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتأكيد تضخيم القالب تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 302 نانومتر.

بعد ذلك ، أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم تقييد DPN1 إلى 25 ميكرولترا المتبقية من مزيج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). احتضان المزيج لمدة ساعتين ونصف عند 37 درجة مئوية لهضم الحمض النووي للقالب الميثيلي. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من خمسة إلى 10 ميكرولترات من الخليط المهضوم إلى 100 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة بالصدمة الحرارية واحتضانها على الجليد لمدة 60 دقيقة.

بعد ذلك ، صدم خليط الحمض النووي الخلوي بالحرارة عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية على كتلة حرارية جافة. ثم احتضن الخليط على الفور على الثلج لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، أضف 900 ميكرولتر من مرق LB إلى الخلايا وانقل المعلق إلى أنبوب معقم ذو قاع دائري سعة 14 مل.

احتضن عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 190 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك ، انشر حبيبات الخلايا بالطرد المركزي على ألواح أجار المكملة بالمضادات الحيوية. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من اللوحة إلى خمسة ملليلتر من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية. بعد ذلك ، قم بزراعة الثقافة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر. قم بتحويل بلازميد بقايا السيستين المتحولة إلى خلايا الإشريكية القولونية عن طريق معالجة الصدمة الحرارية ، متبوعا بزراعة المزرعة بين عشية وضحاها في وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية.

في اليوم التالي ، انشر مباشرة 150 ميكرولترا من تعليق الخلية على ألواح أجار LB المكملة بالكاناميسين ، واحتفظ بالصفائح للحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل مستعمرة واحدة بشكل معقم في 20 مل من وسط LB في قارورة Erlenmeyer ، واتركها للحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل المزرعة الليلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم, بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي للسائل بين عشية وضحاها في 2, 400 مرات G لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من متوسط M9 الأدنى إلى حبيبات الخلية ثم قم بتعليق الخليط الخلوي في لتر واحد من وسط M9 الذي يحتوي على الكاناميسين. استمر في زراعة مزرعة السائل M9 عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند حوالي 190 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى حوالي 0.6 إلى 0.8.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرومولار من IPTG إلى ثقافة M9 للحث على التعبير عن البروتين واترك المزرعة تنمو بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتقطيع الخلايا البكتيرية من المزرعة الليلية عن طريق الطرد المركزي عند حوالي 10 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام ماصة نقل آلية سعة 10 ملليلتر ، قم بتجانس حبيبات الخلية البكتيرية المجمدة في حوالي 40 مل من المخزن المؤقت للتجانس.

ثم احتضان الجانس في فرن تهجين لمدة 90 دقيقة مع دوران مستمر. الطرد المركزي للخليط عند حوالي 15،000 مرة G عند ثماني درجات مئوية لمدة 40 دقيقة لفصل جزء البروتين القابل للذوبان عن الحبيبات غير القابلة للذوبان. بعد ذلك ، أضف 50٪ من الحجم من حيث الحجم من ملاط حبة الاغاروز وحمض النيكل النتريلوترياتيك إلى المادة الطافية واحتضانها عن طريق الانعكاس في فرن التهجين لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، استخدم عمود تنقية بروتين تدفق الجاذبية لجمع حبات الاغاروز ببروتين يحمل علامة سداسي هيستيدين متصل بالنيكل. أخيرا ، اغسل حبات الاغاروز التي تم جمعها ثلاث مرات. قم بتخطيب البروتينات في سلسلة من جزأين من المليلتر.

بعد ذلك ، تأكد من البروتين المنقى الموسوم بالهيكساهيستيدين في الكسور المملوءة عن طريق تشغيل جل SDS-PAGE الملون باللون الأزرق Coomassie. قم بتجميع أجزاء البروتين المملوءة في غشاء غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 3،500 دالتون واحتضانها في عازلة قابلة للطي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع التحريك المغناطيسي. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من وحدة واحدة من الثرومبين لكل ملليغرام من البروتين إلى البروتين المجمع في غشاء غسيل الكلى واحتضنه مرة أخرى ليوم واحد عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة البروتين من كيس غسيل الكلى وتركيزه بمقدار عشرة أضعاف تقريبا باستخدام مكثف طرد مركزي فائق الترشيح مع قطع الوزن الجزيئي 10،000 دالتون. بعد ذلك ، أعد تخفيف تركيز البروتين حوالي 20 ضعفا في محلول إعادة الطي الخالي من كلوريد الصوديوم. لتنقية البروتين ، قم بتحميله على عمود تبادل الأنيون المعبأ مسبقا متوازن مع نفس المخزن المؤقت الخالي من كلوريد الصوديوم.

ابدأ في تصفية البروتينات في تدرج من صفر إلى 60٪ من كلوريد الصوديوم المولي الذي يحتوي على عازلة قابلة للطي. انقل أجزاء البروتين المجمعة إلى كيس غسيل الكلى. قم بإجراء خطوة غسيل الكلى عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لتبادل البروتين في المخزن المؤقت التجريبي لإعادة الطي مع التركيز المولي الأمثل لكلوريد الصوديوم.

أولا ، قم بتحويل 1.5 مل من حوالي 60 بروتين ميكرومولار إلى لتر واحد من المخزن المؤقت للتعديل لجليكوزيل البروتين. بعد 24 ساعة ، عند أربع درجات مئوية ، انقل البروتين المعدل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف الجلوكوز المذاب DMSO -5-MTS إلى تركيز نهائي يبلغ ملليمولار. اضغط برفق على أنبوب الطرد المركزي الدقيق كل 10 دقائق أثناء احتضان العينة في الظلام لمدة ساعة في درجة الحرارة المحيطة.

بعد الحضانة ، قم بإجراء غسيل الكلى عند أربع درجات مئوية لإعادة تبادل البروتين في المخزن المؤقت التجريبي النهائي. قم بقياس الكتلة الدقيقة للبروتين باستخدام قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي. أخيرا ، استخدم الرنين المغناطيسي النووي للمحلول لحساب كفاءة التعديل وتحديد التغيرات الهيكلية لمخلفات cys الغليكوزيلاتية في البروتين.

يظهر الحمض النووي الناجح لقالب تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل طفريا في هذا التمثيل 1٪ DNA agarose gel. يتم استخدام سلم الحمض النووي وكمية مكافئة من قالب الحمض النووي الذي لم يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل كعناصر تحكم في الجل. يظهر الشريط العلوي مع تلطيخ بروميد الإيثيديوم عالي الكثافة القالب المضخم بالحجم المطلوب.

بعد ذلك ، تم تنقية البروتين باستخدام عمود تبادل الأنيونات. يظهر الكروماتوگرام ملف تعريف شطف لوحظ عند 280 نانومتر باللون الأزرق ، ويظهر ثلاث قمم متطايرة مقابل تدرج كلوريد الصوديوم المشار إليه باللون الأحمر مع زيادة التركيز حتى 0.6 مولار. تظهر اللوحة السفلية جل SDS-PAGE الملون باللون الأزرق من Coomassie من أجزاء البروتين.

تم تحديد الارتباط بالجليكوزيل لبقايا السيستين عن طريق قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي. يظهر الكروماتوجرام كتل البروتين غير المعدل والمعدل قبل وبعد الارتباط بالجليكوزيل لبقايا السيستين. للتأكيد ، تم إجراء الرنين المغناطيسي النووي للمحلول الذي يظهر التراكب الطيفي HSQC للتحولات الكيميائية للأميد المحدد للبقايا ، مما يشير إلى كل من التعديلات والاضطرابات الهيكلية للبروتين الجليكوزيلات.

عندما يتم إتقانها ، يمكن إكمال جميع المراحل من الطفرات إلى تقييم الرنين المغناطيسي النووي في حوالي 12 يوما ، باستثناء وقت الانتظار لتخليق التمهيدي وتسلسل الحمض النووي وخدمات التحليل الطيفي الكتلي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقييم الآثار الهيكلية والفيزيائية الحيوية لطفرات السيستين في حالة عدم وجود تعديل الثيول كقياسات تحكم في خط الأساس. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الاستقرار ، والبنية الثانوية ، وربط الأيونات ، وتقييمات تفاعل البروتين والبروتين ، للكشف عن كيفية تأثر الخصائص الفيزيائية الحيوية لوظائف البروتين الأساسية بالارتباط بالجليكوزيل.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إشارات الكالسيوم لتقييم أدوار الهليون 131 والأسباراجين 171 بشكل فردي وتراكمي والارتباط بالجليكوزيل في جزيء التفاعل اللحمي لإشارات الكالسيوم المرتبطة بدخول الكالسيوم الذي يعمل بالمتجر.