الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا لدراسة CLIC4 HN4 المستحثة بضربه قاضية الخلية المبرمج في المختبر
July 17th, 2018
وهنا يقدم بروتوكول مفصلة لتطبيق والرودامين 123 للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) تحديد ودراسة CLIC4 المستحثة بضربه قاضية HN4 الخلية المبرمج في المختبر. وسجلت تحت مجهر الأسفار الشائعة والليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار، التغيير في الوقت الحقيقي نظام التمثيل التناسبي المختلط.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال البيولوجي الخلوي بما في ذلك فهم موت الخلايا المبرمج وضعف الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمحققين إجراء المراقبة في الوقت الفعلي بسهولة وبشكل صحيح لإمكانات غشاء الميتوكوندريا عبر الرودامين 123 داخل خلية واحدة. استزراع خط خلية HN4 من سرطان حرشفية خلايا الرأس والرقبة كما هو موضح في بروتوكول النص.
قبل يوم واحد من التعدي ، قم بوضع 0.5 مليون خلية في ملليلترين لكل بئر من وسط الثقافة بدون مضادات حيوية في أطباق من ستة آبار. قم بتخفيف 100 بيكومول برفق من الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل CLIC4 أو الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل في 250 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة. ثم قم بتخفيف خمسة ميكرولترات من كاشف الجسيمات الشحمية في 250 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة واحتضانها لمدة خمس دقائق.
امزج الحمض النووي الريبي الصغير المخفف مع الكاشف الشحمي المخفف واخلطه برفق. أضف الخليط إلى كل بئر تحتوي على خلايا متوسطة. تخلط برفق عن طريق هز الطبق ذهابا وإيابا.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط بوسط نمو طبيعي بعد أربع ساعات من التعداد. استمر في احتضان الخلايا لمدة 20 ساعة إضافية قبل الشروع في إجراء وضع العلامات على الرودامين 123.
بعد معالجة الحمض النووي الريبي الصغيرة المتداخلة CLIC4 لخلايا HN4 في ألواح من ستة آبار ، استخدم الملقط لوضع أغطية دائرية في قاع ألواح جديدة مكونة من 12 بئرا. ماصة 150 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل مليلتر بوليسين في منتصف كل غطاء داخل الألواح المكونة من 12 بئرا. بعد دقيقتين ، قم بإزالة البولي ليسين جيدا بواسطة الماصة.
بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة لخلايا HN4 داخل الطبق وأضف ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين لفصل الخلايا. بعد ست دقائق ، أضف ملليلترين من وسط الثقافة لتحييد التربسين. امزج خلايا HN4 برفق بواسطة الماصة خمس مرات وزرع الخلايا على أغطية دائرية.
ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثماني ساعات من الحضانة ، أضف ميكرومولين لكل لتر من الرودامين 123 واخلط الوسط برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان التوزيع المتساوي في الوسط. احتضان خلايا HN4 لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
استخدم الملقط لإزالة أغطية الغطاء ونقلها لفترة وجيزة إلى مخزن NPSS المسخن مسبقا لغسل السائل المتبقي. ضع الغطاء في الجزء السفلي من الحجرة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 500 ميكرولتر مع غطاء زجاجي قابل للاستبدال مقاس 25 ملم محكم الغلق في مكانه بواسطة حلقة O. ثبت الغطاء في مكانه عن طريق شد الغطاء على الغرفة.
أضف 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت NPSS المسخن مسبقا إلى الغرفة المجمعة. ثم ضع الحمام تحت المجال البصري للمجهر الفلوري أو المجهر المضان بالليزر متحد البؤر. قم بتشغيل المجهر الفلوري باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
افتح برنامج نظام التصوير وحدد الزر الجديد من شريط الأوامر لبدء تجربة جديدة. اضبط المجال البصري والتركيز للعثور على موقع الخلايا في الضوء الأبيض. ثم أطفئ الضوء واضغط على الزر لإغلاق الضوء الأبيض.
انقر فوق زر التركيز من شريط الأوامر وحدد بدء التركيز لتشغيل التألق. ابحث عن موقع الخلايا مرة أخرى عبر المجهر بإثارة 507 نانومتر وطول موجة انبعاث طويل التمرير 529 نانومتر. اضبط المجال البصري وركز مرة أخرى إذا لزم الأمر.
حدد حقلا مرئيا يحتوي على 20 إلى 30 خلية HN4 منفصلة فقط. بمجرد تحقيق مجال بصري واضح، انقر فوق التركيز البؤري القريب من شريط التركيز البؤري. ثم انقر فوق الحصول على واحدة من شريط الأوامر للحصول على مجموعة واحدة من الصور.
بعد ذلك ، انقر فوق المناطق من شريط الأوامر وانقر فوق الزر "موافق" لتحرير مناطق القياس. لملاءمة الأشكال المختلفة للخلايا الفردية، حدد أداة منطقة التتبع. ضع دائرة حول منطقة خلية واحدة وانقر نقرا مزدوجا عند الانتهاء.
كرر الإجراء حتى يتم وضع دائرة حول جميع الخلايا. انقر فوق تم وحدد حفظ الصور للعثور على الموقع المحفوظ. انقر فوق ساعة الصفر واضغط بسرعة على F4 لبدء مراقبة تغير شدة التألق.
سجل التغيير في الوقت الفعلي لشدة التألق مرة كل خمس ثوان لمدة خمس دقائق. عندما يصبح خط الأساس مستقرا ، أضف 50 ميكرولترا من NPSS ممزوجا ب 0.5 ميكرولتر من 100 ملليمول لكل لتر ATP إلى الغرفة عبر الماصة. قم بتشغيل المجهر الفلوري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر باتباع تعليمات الشركة المصنعة وافتح البرنامج المرفق.
انقر فوق الهدف أسفل قائمة الاستحواذ لتحديد العدسة الموضوعية الزيتية ذات الفتحة الرقمية 63X 1.4. راقب العينة وابحث عن مجال بصري واضح تحت مجال الضوء. اضغط على زر تحديد الضوء للتبديل إلى وضع التألق وحدد مرشحات التألق الصحيحة للعثور على موقع الخلية تحت الظلام عبر المجهر.
اضغط على الغالق لحماية العينة عند الانتهاء من المراقبة. ضمن قائمة الاستحواذ ، اضبط قناة PMT المناسبة وانقر فوق تحقيق لتنشيط المسار البصري المستقر. انقر فوق قائمة التكوين واختر الليزر لتحديد نوع الليزر المطلوب.
انقر فوق مباشر للحصول على صور في الوقت الفعلي وتأكد من أن المجال المرئي يحتوي فقط على 20 إلى 30 خلية HN4 منفصلة. بعد ذلك ، حدد XYT في وضع الاستحواذ في القائمة الفرعية للاكتساب ضمن قائمة الاستحواذ. قم بتعيين خمس ثوان للفاصل الزمني و 20 دقيقة للمدة.
انقر فوق تطبيق عند تسوية جميع المعلمات. ضمن قائمة القياس الكمي، استخدم أداة رسم خطوط متعددة لوضع دائرة حول منطقة التسجيل لكل خلية. حدد ملف تعريف الخط واختر بدء إجراء المراقبة.
سجل التغيير في الوقت الفعلي لشدة التألق لمدة خمس دقائق. عندما يصبح خط الأساس مستقرا ، أضف 50 ميكرولترا من NPSS ممزوجا ب 0.5 ميكرولتر من 100 ملليمول لكل لتر من ATP إلى الغرفة عبر ماصة. لإجراء تحليل إحصائي باستخدام مجهر مضان مشترك ، افتح برنامج نظام التصوير وحدد زر الفتح من شريط الأوامر لفتح تجربة محفوظة.
انقر فوق المناطق من شريط الأوامر وانقر فوق الزر موافق لتحرير مناطق القياس. حدد أداة منطقة التتبع. ضع دائرة حول منطقة خلية واحدة وانقر نقرا مزدوجا عند الانتهاء.
كرر الإجراء حتى يتم وضع دائرة حول جميع الخلايا. انقر فوق تم وحدد الزر F4 للأمام للحصول على أثر يوضح شدة التألق. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق زر السهم لأسفل الموجود في الزاوية اليمنى السفلية من الرسم البياني وانقر فوق إظهار بيانات الرسم البياني.
انقر فوق "موافق" مرتين واختر زر بيانات السجل لفتح واجهة برنامج معالجة البيانات. ثم انقر فوق بيانات السجل مرة أخرى للعثور على سجلات التذبذب في الوقت الفعلي لشدة التألق التي تظهر في جدول البيانات. تظهر هنا نتائج تمثيلية توضح التغيرات التي يسببها ATP في إزالة استقطاب الميتوكوندريا في خلية HN4 تحت تدخل مختلف كما تم حلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري الشائع.
زاد إزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا بسرعة بعد علاج ATP وتعافى تدريجيا إلى المستوى الطبيعي في كلتا المجموعتين. تظهر الآثار التمثيلية لكثافة الفلورسنت الرودامين -123 معالجة MMP ل CLIC4 RNA الصغير المتداخل عزز إزالة استقطاب الميتوكوندريا عند مقارنته بالمجموعة الضابطة. كشف الرسم البياني التمثيلي أيضا أن ضربة قاضية ل CLIC4 عززت إزالة استقطاب الميتوكوندريا مقارنة بالمجموعة الضابطة.
هنا ، تظهر نتائج الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر التمثيلية أيضا تغيرات ناتجة عن ATP في إزالة استقطاب الميتوكوندريا في خلية HN4 تحت تدخل مختلف. يزداد إزالة الاستقطاب من غشاء الميتوكوندريا بسرعة بعد علاج ATP ويتعافى تدريجيا إلى المستوى الطبيعي في كلتا المجموعتين. تظهر الآثار التمثيلية لكثافة الفلورسنت للرودامين -123 أن معالجة MMP للحمض النووي الريبي الصغير المتداخل CLIC4 عزز إزالة استقطاب الميتوكوندريا مقارنة بالمجموعة الضابطة.
وبالمثل ، كشف الرسم البياني التمثيلي أيضا أن ضربة قاضية ل CLIC4 عززت إزالة استقطاب الميتوكوندريا مقارنة بالمجموعة الضابطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم أفضل لكيفية استخدام الرودامين 123 لإجراء مراقبة في الوقت الفعلي لإمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق كل من الفحص المجهري الفلوري العادي والفحص المجهري بالليزر متحد البؤر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية الفحص المجهري هذه باستخدام الرودامين 123 في أقل من 20 دقيقة لعينة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم الاتصال بالغرفة أثناء الحقن في انتظار عملية المسح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Western Blot وقياس التدفق الخلوي للإجابة على المزيد من الأسئلة مثل ما إذا كان موت الخلايا المبرمج أو النخر قد حدث. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم الحية لاستكشاف الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وإيجاد دليل قوي على موت الخلايا المبرمج الخلوي في الخلايا الحية المختلفة.
لا تنس أن العمل مع الرودامين 123 يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وأقنعة الوجه أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تعرض هذه المقالة بروتوكولًا لاستخدام الرودامين 123 لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) والتحقيق في موت الخلايا المبرمج الناجم عن تقليل CLIC4 في خلايا HN4. تسمح الطريقة بالمراقبة في الوقت الحقيقي لتغيرات MMP باستخدام تقنيات مجهر الفلوريسنس.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- بحوث موت الخلايا المبرمج
- وظيفة الميتوكوندريا
الخلفية
- فهم موت الخلايا المبرمج واختلال وظيفة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية في علم الأحياء الخلوية.
- الرودامين 123 هو صبغة فلوريسنس يستخدم لقياس MMP.
- CLIC4 متورط في آليات موت الخلايا المبرمج في الخلايا.
- تُشتق خلايا HN4 من سرطان الخلايا الحرشفية للرأس والرقبة.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لتقييم MMP في خلايا مفردة.
- التحقيق في تأثيرات تقليل CLIC4 على موت الخلايا المبرمج.
- تعزيز فهم أدوار الميتوكوندريا في موت الخلايا المبرمج.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا HN4 في لوحات سداسية البئر بدون مضادات حيوية.
- نقل خلايا CLIC4 أو siRNA المختلطة باستخدام كواشف الليبوزوم.
- مراقبة تغيرات MMP في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات مجهر الفلوريسنس.
- تحليل تأثيرات تقليل CLIC4 على معدلات موت الخلايا المبرمج.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق المراقبة في الوقت الحقيقي لـ MMP بنجاح.
- أدى تقليل CLIC4 إلى زيادة معدلات موت الخلايا المبرمج في خلايا HN4.
- أظهر البروتوكول سهولة الاستخدام للباحثين.
- تساهم النتائج في فهم اختلال وظيفة الميتوكوندريا في السرطان.
الاستنتاجات
- بروتوكول الرودامين 123 فعال لدراسة MMP.
- يلعب CLIC4 دورًا مهمًا في تنظيم موت الخلايا المبرمج في خلايا HN4.
- يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الأبحاث المستقبلية حول موت الخلايا المبرمج المرتبط بالميتوكوندريا.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) provides early mechanistic insight into apoptosis induction, enabling target validation in oncology drug discovery. Real-time MMP monitoring using rhodamine 123 supports mechanistic de-risking by linking molecular perturbations to functional mitochondrial outcomes. This approach enhances predictive confidence in early-stage target evaluation by capturing apoptosis commitment prior to morphological changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring MMP collapse as an early apoptotic event following CLIC4 knockdown.
- Operational Value: Enables real-time, single-cell resolution of mitochondrial dysfunction using accessible fluorescence microscopy.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating genetic intervention with functional mitochondrial readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity trajectories to assess compound-induced MMP changes.
- Operational Value: Standardizes MMP measurement across cell populations using defined excitation/emission settings (507 nm/529 nm).
- Scalability: Compatible with both widefield and confocal platforms for flexible assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges target modulation to mitochondrial phenotype in disease-relevant HN4 carcinoma cells.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether apoptosis proceeds via mitochondrial pathway following target knockdown.
- Preclinical Alignment: Supports biomarker-advanced decision-making by linking CLIC4 suppression to MMP dysregulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement must be functionally validated before phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests whether CLIC4 knockdown engages the mitochondrial apoptosis pathway in HN4 cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative MMP readouts suitable for compound library interrogation.
- Analytics: Enables longitudinal tracking of fluorescence intensity to calculate depolarization kinetics and area-under-curve metrics.
- Translational Research: Anchors target effects in a carcinoma model with mitochondrial apoptosis relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable MMP assay platform applicable across oncology target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on apoptosis initiation through direct MMP measurement.
- Operational Value: Requires only standard fluorescence or confocal microscopy, minimizing specialized infrastructure.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target-mediated mitochondrial commitment to apoptosis.
- Portfolio Impact: Reduces false-positive target progression by validating mechanistic fidelity early.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to fluorescence microscopes with appropriate filter sets (ex: 507 nm/529 nm).
- Necessitates standardization of staining duration, dye concentration, and wash steps across users.
- Must account for dye toxicity and efflux variability in long-term assays.
- Limited to adherent or semi-adherent cells compatible with coverslip-based imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Cell Transfection
2:08
Rh123 Labeling
4:21
Detection of the Mitochondrial Membrane Potential (MMP)
6:29
Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope
8:34
Statistical Analysis
9:48
Results: Detection of Mitochondrial Membrane Potential via Normal Fluorescent Microscopy and Confocal Laser Scanning Microscopy
11:53
Conclusion
