توليد نماذج خلية سرطان البروستاتا لمقاومة دوسيتاكسيل عامل مكافحة الانقسامية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نماذج تجريبية للخلايا السرطانية المقاومة للدوسيتاكسيل كمنصة لدراسة الآليات الجزيئية التي تقود مقاومة العلاج المضاد للانقسام. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلايا السرطانية والمجالات الجينومية ، مثل تحديد مسارات الإشارات التي تساهم في تطور المرض ، وتحديد الاستراتيجيات المحتملة القابلة للاستهداف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة موثوقة وسهلة لإنشاء نماذج تجريبية لدراسة استجابات الأدوية المضادة للسرطان إلى جانب استخدام عينات أورام المريض والنماذج الحيوانية.

ستظهر الإجراء ليزا موهر ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري ، وجونجريم وو ، باحثة ما بعد الدكتوراه الأخرى في فريقنا. لبدء هذا الإجراء ، قم بلوحة خلايا DU145 أو 22Rv1 في قوارير مربعة تبلغ مساحتها 150 سم تحتوي على 20 مل من الوسائط. بعد 24 ساعة ، عندما تكون الخلايا عند حوالي 70 إلى 80٪ من التقاء ، أضف Docetaxel عند خمسة نانو ضرس.

بعد 72 ساعة ، قم بشفط الوسائط التي تحتوي على الدواء ، وأضف وسائط جديدة خالية من الدوسيتاكسل. قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. انتظر لمدة أسبوع إلى أسبوعين حتى تظهر المستنسخة في القارورة.

قم بشفط الوسائط ، واغسل الخلايا بعناية باستخدام 15 مل من PBS واحتضانها بأربعة ملليلتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا عن سطح القارورة. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا التربسينية من القارورة باستخدام ثمانية ملليلتر من الوسائط الطازجة. اسحب الخلايا من جميع القوارير المعالجة وحبيبها عن طريق الطرد المركزي.

بعد ذلك ، قم بإزالة superna-den ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من الوسائط الجديدة ، وقم بوضع الخلايا في قوارير مربعة 150 سم. بعد 24 ساعة ، عندما تكون الخلايا عند التقاء حوالي 70 إلى 80٪ ، أضف خمسة نانومولار دوسيتاكسيل مرة أخرى. كرر الإجراءات كما هو موضح سابقا حتى تظهر المستنسخة في القارورة.

ثم ضع الزنازين في قوارير مساحتها 150 سم مربع مرة أخرى. بعد 24 ساعة ، عندما تكون الخلايا عند التقاء حوالي 70 إلى 80٪ ، عالجها ب 10 نانومولار دوسيتاكسل. كرر نفس الخطوات بطريقة تصاعد جرعة الدوسيتاكسيل ، واستمر في تجميع المستنسخة الباقية بعد كل علاج تركيز.

في نهاية العملية ، ستحصل على مجموعة من الخلايا المقاومة الجاهزة للاستخدام التجريبي. في هذا الإجراء ، اللوحة 2 ، 000 خلية باستخدام 2 ملليلتر من الوسائط لكل بئر في ألواح الآبار الستة. بعد 24 ساعة ، أضف تركيزات متزايدة من دوسيتاكسيل لكل من خطوط خلايا DU145 و 22Rv1.

أضف DMSO إلى بئر واحد فقط كعنصر تحكم بنفس الحجم المستخدم لأعلى جرعة من Docetaxel. بعد 72 ساعة ، قم بشفط الوسائط التي تحتوي على الدواء ، وأضف وسائط جديدة خالية من الدوسيتاكسل. احتضن الصفائح لمدة أسبوع إلى أسبوعين حتى تظهر المستعمرات تحت المجهر.

لتلطيخ المستعمرات ، اغسلها برفق باستخدام ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من PBS. احتضنها بملليلترين إلى ثلاثة ملليلتر من محلول البنفسجي البلوري لمدة 20 دقيقة داخل غطاء مزرعة الأنسجة أو غطاء الدخان. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول القائم واغسل الأطباق بملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من الماء.

ثم قم بإزالة الماء وجفف الألواح بالهواء. التقط صورا رقمية للوحات لتمثيل الشكل. قم بتحليل النتيجة عن طريق تصور الآبار ، وعد المستعمرات يدويا بمساعدة قلم علامة.

وتمثيل النسبة المئوية لصلاحية الخلية في الرسم البياني. فيما يلي رسم تخطيطي يوضح تحديد Docetaxel IC50 في خطوط خلايا سرطان البروستاتا الأبوية DU145 و 22Rv1. يتم عرض النسب المئوية المتوقعة لصلاحية الخلية في جرعة دوسيتاكسيل المركزات المتزايدة المطلوبة هنا.

وإليك صور مجهرية برايتفيلد التمثيلية لخلايا DU145 و 22Rv1 في الأوقات المشار إليها أثناء توليد مقاومة الدوسيتاكسل. تشير الأسهم الحمراء إلى استنساخ مقاوم لدوسيتاكسيل بعد اكتمال البروتوكول. تظهر هنا فحوصات تكوين المستعمرة التمثيلية المقابلة للتحقق الوظيفي من الخلايا المقاومة للدوسيتاكسل.

تعرضت الخلايا لزيادة تركيزات الدوسيتاكسيل والبقاء على قيد الحياة عن طريق تلطيخ البنفسج البلوري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء خطوط الخلايا المقاومة للأدوية والتحقق من صحتها ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في الفحوصات والإجراءات التي تختارها مثل تحليل التعبير الجيني والتلاعب الجيني. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.