حجم كبير، الإضاءة ذات الصلة سلوكيا أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنشاء مصباح مناشئ كبير الحجم مناسب تماما للتلاعب البصري الوراثي في الرئيسيات غير البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيف تساهم مجموعات الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في السلوك ، وكيف يمكن أن تؤثر أنماط إطلاق الخلايا العصبية المحددة زمنيا في منطقة ما على منطقة أخرى؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم الضوء ، وبالتالي تسمح بالتلاعب البصري الوراثي لأحجام الدماغ الكبيرة ذات الصلة سلوكيا مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى الطب الانتقالي بسبب أوجه التشابه بين أدمغة الرئيسيات البشرية وغير البشرية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الأمر يتطلب بعض الممارسة لتطبيق القدر المناسب من الضغط عند سحب هذه الألياف. لبدء هذا الإجراء ، استخدم زوجا من المقصات الحادة لقطع قسم من الألياف الضوئية البلاستيكية بقطر 250 ميكرومتر أطول بمقدار 10 سم على الأقل من إجمالي طول الإضاءة المطلوب.

بعد ذلك ، قم بإزالة 15 إلى 20 سم من سترة البولي إيثيلين من أحد طرفي الألياف الضوئية البلاستيكية باستخدام أداة إزالة الأسلاك قياس 22. بعد ذلك ، قم بتأمين أقصى ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات من الطرف المجرد للألياف في مشبك نائب الطاولة. أمسك الطرف المغلف للألياف المشدودة بيد واحدة ، مع سحب ثابت ثابت.

يجب أن تكون الألياف موازية للأرض ، ويتم سحبها بعيدا عن الرذيلة. حافظ على هذا التوتر المستمر على الألياف طوال فترة التسخين والتبريد ، بحيث تظل الألياف مستقيمة ومشدودة أثناء تخفيفها. باستخدام أدنى إعداد لمسدس حراري مزدوج درجة الحرارة ، قم بتسخين الجزء المجرد من الألياف حتى يتم تخفيفه إلى قطر 60 إلى 100 ميكرومتر ، أو حوالي قطر شعرة الإنسان.

حافظ على التوتر المستمر على الألياف مع السماح لها بالتبريد. قد يؤدي عدم الحفاظ على التوتر أو ارتفاع درجة حرارة الألياف إلى تجعد الألياف أو كسرها. للمساعدة في الحفاظ على التوتر المستمر على الألياف أثناء تسخينها ، استخدم يدك غير المهيمنة حتى لا تضطر إلى تركها عند استخدام المسدس الحراري.

أيضا ، يمكنك لف الألياف برفق حول راحة يدك للحصول على قبضة أفضل. بمجرد أن تبرد الألياف تماما ، وتحقيق القطر المطلوب ، اضغط على الألياف ثلاثة سنتيمترات من أضيق نقطة على كلا الجانبين. مع سحب حاد سريع على طول محور الألياف ، افصل الجانبين لإنشاء طرف مدبب.

ثم افحص الطرف المدبب بقوة منخفضة تحت مجهر التشريح. إذا كان الطرف متشعبا أو مجعدا ، فتخلص من الألياف. حتى مع وجود الكثير من الممارسة ، فإن حوالي ثلث الألياف سيكون لها أطراف متشعبة أو مجعدة.

نحن فقط نتخلص من هذه الألياف بدلا من محاولة إصلاحها ، نظرا لأنه من السهل جدا وغير المكلف سحب واحدة أخرى. استعد لحفر الطرف المدبب عن طريق وضع قطعة من شريط المختبر بالقرب من نهاية الطرف ، مع ترك طول الطرف المطلوب مكشوفا. هنا تتعرض المليمترات الخمسة الأخيرة.

يحمي الشريط الألياف من النقش فوق الطول المطلوب لانبعاث الضوء. بعد ذلك ، قم بطي مربع صغير من ورقة لف كربيد السيليكون بحجم خمسة ميكرومتر بين الإبهام والسبابة. ضع طرف الألياف بين جانبي ورقة اللف ، وحفر الألياف برفق باستخدام حركات دائرية صغيرة.

قم بتدوير الألياف بشكل متكرر بحيث يتم حفر جميع الجوانب بالتساوي. بعد ذلك ، قم بإزالة حوالي خمسة ملليمترات من سترة البولي إيثيلين من الطرف المقابل للمصباح باستخدام أداة تجرد الأسلاك قياس 22. ثم اقطع الطرف المقابل بشكل مسطح بسكين ساخن لتنعيم السطح.

قم بتثبيت موصل في نهاية المصباح المقابل للطرف المحفور. هذا يسمح للإضاءة بالاتصال بكابل بصري أو ليزر. بعد ذلك ، قم بتلميع الطرف المقابل بشكل مسطح باستخدام أوراق لف أدق على التوالي.

بعد ذلك ، أدخل الطرف المقابل المسطح في طويق من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي 260 ميكرومتر حتى يتدفق مع نهاية الطويق. تأكد بصريا من أن الطرف المقابل مصقول بسلاسة وبشكل متساو باستخدام مجهر الألياف. قم بلصق الطويق عموديا على حافة الطاولة مع توجيه الفتحة الأصغر للحلقة لأسفل.

بعد ذلك ، املأ حقنة سعة مليلتر واحد بالإيبوكسي البلاستيكي وقم بإرفاق إبرة غير حادة عيار 18 بالمحقنة. بعد ذلك ، استخدم الإبرة لتطبيق الايبوكسي في الطويق. املأ الطويق بالكامل بالإيبوكسي.

أدخل الألياف في الطويق بحيث يتدفق مع قاع الطويق. إذا لزم الأمر ، امسح أي إيبوكسي زائد من السطح المصقول للألياف بمنديل مبلل خال من النسالة قبل التجفيف. في هذه الخطوة ، قم بإعداد محرك أقراص صغير برجي قبل كل جلسة اختبار.

ثم قم بتثبيت أنبوب توجيه قياس 25 بطرف مشطوف على المشبك السفلي على محرك الأقراص. قم بتأمين مصباح الصوت الكبير في المشبك العلوي على نفس محرك الأقراص. هذا المشبك متصل بمحرك القيادة.

بعد ذلك ، قم بربط مصباح الإضاءة بالحجم الكبير عبر أنبوب التوجيه بالكامل ، وتأكد من أن طرف المصباح يمتد إلى ما بعد طرف أنبوب التوجيه. بالتناوب ، يمكن تطبيق شريط المختبر على الألياف بحيث يتم تثبيت الشريط ، بدلا من الألياف نفسها ، لحماية الألياف. بعد ذلك ، انقع أنبوب التوجيه والإضاءة في محلول مطهر للتعقيم.

ضع شبكة معقمة مخصصة مع تباعد ثقب واحد ملليمتر داخل الغرفة النظيفة ، وقم بتثبيتها في اتجاه محدد مسبقا باستخدام المسمار الموجود على جانب الغرفة. اسحب المصباح المعقم من أنبوب التوجيه عن طريق سحب المصباح لأعلى باستخدام ملقط غير حاد معقم. يجب أن يكون طرف المصباح من خمسة إلى 10 ملليمترات فوق طرف أنبوب التوجيه.

بتثبيت محرك الأقراص الصغيرة على الحامل وضع أنبوب التوجيه في فتحة الشبكة المستهدفة. بعد ذلك ، قم بخفض مرحلة microdrive حتى يمر أنبوب التوجيه بمستوى الجافية. في الوقت نفسه ، قم بخفض المصباح يدويا باستخدام ملقط معقم.

إذا كانت هناك أي مقاومة ، فقم بسحب المصباح من خمسة إلى 10 ملليمترات ، وانتظر 10 دقائق ، وحاول مرة أخرى. إذا كانت لا تزال هناك مقاومة في المحاولة الثانية ، فقم بسحب طرف المصباح إلى أنبوب التوجيه ، وقم بخفض أنبوب التوجيه 0.25 ملم ، وحاول مرة أخرى. قم بتوصيل الطويق الموجود على الطرف الآخر من المصباح بالإعداد البصري الأكبر أو الليزر.

يوضح هذا الشكل أن معدلات الخطأ زادت بشكل كبير مع الإضاءة. وتظهر المخططات النقطية هنا تثبيط الخلايا العصبية التي تمتد على سمك 2.5 ملليمتر من القشرة. وإمكانات المجال المحلي التي تظهر القطعة الأثرية الضوئية التي تمتد على 4.5 ملم.

بمجرد إتقانها ، يمكن إنشاء مصباح كبير الحجم باستخدام هذه التقنية في غضون 10 إلى 15 دقيقة ، بالإضافة إلى وقت تجفيف الإيبوكسي. تضيف المعايرة نصف ساعة أخرى أو نحو ذلك ، لذلك لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ، عادة ما نصنع عدة مصابيح في وقت واحد. أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن العديد من المصابيح لن تفي بمعايير مراقبة الجودة.

هذا تمام. إذا فشلوا في فحص الإكرامية ، فإننا نتجاهلهم. ولكن إذا فشلوا في المعايرة ، فعادة ما نقوم بإعادة صقلها وتكرار المعايرة.

بعد تطويرها ، ساعدت هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستخدام علم البصريات الوراثي لقمع إطلاق الخلايا العصبية وتعديل السلوك في الرئيسيات غير البشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مصباح إضاءة كبير الحجم.