الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

الهدف العام من اختبار ورم خبيث رئوي هو تصور ودراسة نمو خلايا الساركوما العظمية النقيلية في أنسجة الرئة القابلة للحياة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حقا في مجال ورم خبيث الساركوما العظمية. مثل كيفية تكيف خلايا الساركوما العظمية النقيلية والبقاء على قيد الحياة والتكاثر في البيئة الدقيقة للرئة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور المباشر لنمو خلايا الساركوما العظمية النقيلية في بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد ذات صلة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، بسبب الخطوات الصعبة تقنيا لقنية القصبة الهوائية ونفخ الرئة. يتم حقن الوريد الذيل للخلايا السرطانية والقتل الرحيم للفأر وفقا للإرشادات المؤسسية القياسية.

بعد خمس دقائق ، ضع الفأر القتل رحيم في الاستلقاء الظهري على وسادة معقمة في غطاء التدفق الصفحي ، واستخدم مقصا صغيرا معقما لتشريح القص بعناية ، بعد المدخل الصدري على جانبي القصبة الهوائية ، دون ثقب الرئتين. يعد تشريح جميع العضلات والأنسجة الضامة المحيطة بالقصبة الهوائية أمرا ضروريا لنجاح القنية. بعد ذلك ، استخدم قسطرة وريدية عيار 20 لقنية القصبة الهوائية بعناية واستخدم خياطة كاتغوت معقمة لتأمين القسطرة والقصبة الهوائية بشكل فضفاض.

قم بإرفاق مجموعة تمديد IV من القسطرة إلى حقنة 10 مليلتر لجهاز وفرة الجاذبية وصب 37 درجة مئوية من الاغاروز السائل الممزوج بمحلول متوسط في المحقنة. املأ الرئتين بمحلول الاغاروز حتى تنفخ تماما. ثم قم بإزالة القنية واربط الخيط بإحكام لمنع تسرب محلول الاغاروز.

من المهم الحفاظ على الرئة سليمة أثناء النفخ. النفخ المناسب مع الاغاروز والتبريد اللاحق للنتف ، سيحافظ على الرئة في حالة موسعة. احصد النتف والقصبة الهوائية والقلب والرئة ، مع الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح الرئة.

ضع الأنسجة في 30 مل من PBS المبرد مسبقا المكملة بالمضادات الحيوية ، واترك الاغاروز يتصلب. ضع النتف على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، استخدم مقصا ناعما وملاقطا لتقطيع الرئة إلى قطع 3 × 1.5 ملم ، وضع الشرائح في آبار فردية من صفيحة 6 آبار تحتوي على إسفنج جيلاتين 2 × 2 سم منقوعة مسبقا في وسط B.

في يوم التصوير ، انقل شرائح الرئة بعناية من لوحة 6 آبار ، إلى طبق دائري زجاجي معقم 35 ملم في أعمدة وفقا لمجموعتهم التجريبية. بعد ذلك ، على مجهر مضان واسع المجال ، حدد الهدف 2.5x وقم بتعيين معلمات التصوير لتوفير أفضل تباين بين الخلايا السرطانية الفلورية وأنسجة الخلفية غير الفلورية في مجموعة عينة الأنسجة التحكمية. قم بتصوير جميع العينات باستخدام نفس المعلمات الخاصة بأنسجة التحكم.

إذا لم تتم معايرة البرنامج، فقم بتصوير ميكرومتر باستخدام نفس الهدف مثل أنسجة الرئة للحصول على مرجع مقياس، واحفظ جميع الصور كملفات tif. عند الحصول على جميع الصور ، لتحليل الصور في ImageJ ، افتح الملف الأول. استخدم أداة تحديد المضلع لتحديد شريحة الرئة بأكملها لتحديد مساحة شريحة الرئة الإجمالية.

حدد العملية وطرح الخلفية. اضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على قيمة مبدئية تبلغ 50 بكسل. ستعتمد هذه القيمة على درجة تألق الخلفية ويجب تحسينها لكل مجموعة بيانات.

تأكد من إلغاء تحديد الخلفية الفاتحة. حدد الصورة والكتابة ، 8 بت ، ثم الصورة والخصائص ، أدخل وحدات البكسل. تحت وحدة الطول ، أدخل 1 لعرض البكسل وارتفاع البكسل وعمق فوكسل.

بعد ذلك، تحقق من العمومي لتطبيق هذه المعلمات على جميع الصور اللاحقة. بعد ذلك ، حدد الصورة ، ثم اضبط ، ثم الحد. قم بتمييز الافتراضي والأبيض والأسود ، واستخدم شريط التمرير لعتبة الصورة بحيث يتم تمييز غالبية الخلايا السرطانية بدقة.

انقر فوق تطبيق مرة واحدة لتحويل الرئة إلى اللون الأسود والآفات الفلورية بيضاء. ثم انقر فوق تطبيق مرة ثانية لعكس الصورة بحيث تتحول جميع هياكل الفلورسنت إلى اللون الأسود. لتحديد عدد وشكل الآفات ، حدد التحليل وتعيين القياسات ، وتحقق من المنطقة.

قم بإلغاء تحديد جميع المربعات الأخرى. بعد ذلك ، حدد تحليل الجسيمات وفي حقل الحجم استخدم مساحة أصغر آفة تم تحديدها لتكون خلية واحدة بواسطة ImageJ ، لتعيين نطاق الأشكال التي سيقوم البرنامج بتعدادها. استخدم صورة من مجموعة مركبات اليوم صفر لاختيار أصغر منطقة تعتبر خلية ورمية واحدة.

عند تعيين الحد الأدنى ، انقر فوق موافق. ستظهر نافذة نتائج تحتوي على جميع الأشكال المدرجة وقياسات المساحة. بعد ذلك ، انسخ البيانات والصقها من نافذة النتائج في جدول بيانات ، واستخدم دالة المجموع الرياضي لإضافة جميع مناطق الآفات النقيلية لشريحة الرئة المعينة.

تظهر الميول النقيلية لخطوط الخلايا النقيلية العالية والمنخفضة بصريا خلال النقاط الزمنية التقدمية. وبشكل أكثر تحديدا ، تظهر صور الفحص المجهري هذه كيف يمكن للخلايا النقيلية العالية استعمار الرئة بشكل أكثر كفاءة من خطوط الخلايا النقيلية المنخفضة. يؤكد تحليل الصور والقياس الكمي والتحليل الإحصائي لبيانات الصورة أن الخلايا السرطانية عالية النقيلية يمكنها استعمار أنسجة الرئة بكفاءة.

في حين أن الخلايا النقيلية المنخفضة لا يمكن أن تنمو على الإطلاق. يسمح الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر عالي التكبير بتصور خلايا حمة الرئة بتفاصيل مكانية كبيرة مقارنة ب EGFP التي تعبر عن الخلايا السرطانية. وكذلك يسهل تحليل الهياكل الخلوية ، مثل هذه الميتوكوندريا.

اعتمادا على عدد الفئران المستخدمة ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بمعدات جراحية نظيفة ومعقمة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السرطان لاستكشاف تطور ورم خبيث في رئتي الفئران.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات زراعة الخلايا في المختبر والنشاف الغربي للإجابة على أسئلة إضافية حول تأثيرات الضربة القاضية الجينية أو العلاج بالعقاقير على الخلايا السرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص ورم خبيث رئوي. لا تنس أن العمل مع الخلايا السرطانية البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات مثل العمل في مختبر السلامة الحيوي ، يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.