الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية
March 12th, 2018
والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
الهدف العام من اختبار ورم خبيث رئوي هو تصور ودراسة نمو خلايا الساركوما العظمية النقيلية في أنسجة الرئة القابلة للحياة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حقا في مجال ورم خبيث الساركوما العظمية. مثل كيفية تكيف خلايا الساركوما العظمية النقيلية والبقاء على قيد الحياة والتكاثر في البيئة الدقيقة للرئة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور المباشر لنمو خلايا الساركوما العظمية النقيلية في بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد ذات صلة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، بسبب الخطوات الصعبة تقنيا لقنية القصبة الهوائية ونفخ الرئة. يتم حقن الوريد الذيل للخلايا السرطانية والقتل الرحيم للفأر وفقا للإرشادات المؤسسية القياسية.
بعد خمس دقائق ، ضع الفأر القتل رحيم في الاستلقاء الظهري على وسادة معقمة في غطاء التدفق الصفحي ، واستخدم مقصا صغيرا معقما لتشريح القص بعناية ، بعد المدخل الصدري على جانبي القصبة الهوائية ، دون ثقب الرئتين. يعد تشريح جميع العضلات والأنسجة الضامة المحيطة بالقصبة الهوائية أمرا ضروريا لنجاح القنية. بعد ذلك ، استخدم قسطرة وريدية عيار 20 لقنية القصبة الهوائية بعناية واستخدم خياطة كاتغوت معقمة لتأمين القسطرة والقصبة الهوائية بشكل فضفاض.
قم بإرفاق مجموعة تمديد IV من القسطرة إلى حقنة 10 مليلتر لجهاز وفرة الجاذبية وصب 37 درجة مئوية من الاغاروز السائل الممزوج بمحلول متوسط في المحقنة. املأ الرئتين بمحلول الاغاروز حتى تنفخ تماما. ثم قم بإزالة القنية واربط الخيط بإحكام لمنع تسرب محلول الاغاروز.
من المهم الحفاظ على الرئة سليمة أثناء النفخ. النفخ المناسب مع الاغاروز والتبريد اللاحق للنتف ، سيحافظ على الرئة في حالة موسعة. احصد النتف والقصبة الهوائية والقلب والرئة ، مع الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح الرئة.
ضع الأنسجة في 30 مل من PBS المبرد مسبقا المكملة بالمضادات الحيوية ، واترك الاغاروز يتصلب. ضع النتف على الثلج لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، استخدم مقصا ناعما وملاقطا لتقطيع الرئة إلى قطع 3 × 1.5 ملم ، وضع الشرائح في آبار فردية من صفيحة 6 آبار تحتوي على إسفنج جيلاتين 2 × 2 سم منقوعة مسبقا في وسط B.
في يوم التصوير ، انقل شرائح الرئة بعناية من لوحة 6 آبار ، إلى طبق دائري زجاجي معقم 35 ملم في أعمدة وفقا لمجموعتهم التجريبية. بعد ذلك ، على مجهر مضان واسع المجال ، حدد الهدف 2.5x وقم بتعيين معلمات التصوير لتوفير أفضل تباين بين الخلايا السرطانية الفلورية وأنسجة الخلفية غير الفلورية في مجموعة عينة الأنسجة التحكمية. قم بتصوير جميع العينات باستخدام نفس المعلمات الخاصة بأنسجة التحكم.
إذا لم تتم معايرة البرنامج، فقم بتصوير ميكرومتر باستخدام نفس الهدف مثل أنسجة الرئة للحصول على مرجع مقياس، واحفظ جميع الصور كملفات tif. عند الحصول على جميع الصور ، لتحليل الصور في ImageJ ، افتح الملف الأول. استخدم أداة تحديد المضلع لتحديد شريحة الرئة بأكملها لتحديد مساحة شريحة الرئة الإجمالية.
حدد العملية وطرح الخلفية. اضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على قيمة مبدئية تبلغ 50 بكسل. ستعتمد هذه القيمة على درجة تألق الخلفية ويجب تحسينها لكل مجموعة بيانات.
تأكد من إلغاء تحديد الخلفية الفاتحة. حدد الصورة والكتابة ، 8 بت ، ثم الصورة والخصائص ، أدخل وحدات البكسل. تحت وحدة الطول ، أدخل 1 لعرض البكسل وارتفاع البكسل وعمق فوكسل.
بعد ذلك، تحقق من العمومي لتطبيق هذه المعلمات على جميع الصور اللاحقة. بعد ذلك ، حدد الصورة ، ثم اضبط ، ثم الحد. قم بتمييز الافتراضي والأبيض والأسود ، واستخدم شريط التمرير لعتبة الصورة بحيث يتم تمييز غالبية الخلايا السرطانية بدقة.
انقر فوق تطبيق مرة واحدة لتحويل الرئة إلى اللون الأسود والآفات الفلورية بيضاء. ثم انقر فوق تطبيق مرة ثانية لعكس الصورة بحيث تتحول جميع هياكل الفلورسنت إلى اللون الأسود. لتحديد عدد وشكل الآفات ، حدد التحليل وتعيين القياسات ، وتحقق من المنطقة.
قم بإلغاء تحديد جميع المربعات الأخرى. بعد ذلك ، حدد تحليل الجسيمات وفي حقل الحجم استخدم مساحة أصغر آفة تم تحديدها لتكون خلية واحدة بواسطة ImageJ ، لتعيين نطاق الأشكال التي سيقوم البرنامج بتعدادها. استخدم صورة من مجموعة مركبات اليوم صفر لاختيار أصغر منطقة تعتبر خلية ورمية واحدة.
عند تعيين الحد الأدنى ، انقر فوق موافق. ستظهر نافذة نتائج تحتوي على جميع الأشكال المدرجة وقياسات المساحة. بعد ذلك ، انسخ البيانات والصقها من نافذة النتائج في جدول بيانات ، واستخدم دالة المجموع الرياضي لإضافة جميع مناطق الآفات النقيلية لشريحة الرئة المعينة.
تظهر الميول النقيلية لخطوط الخلايا النقيلية العالية والمنخفضة بصريا خلال النقاط الزمنية التقدمية. وبشكل أكثر تحديدا ، تظهر صور الفحص المجهري هذه كيف يمكن للخلايا النقيلية العالية استعمار الرئة بشكل أكثر كفاءة من خطوط الخلايا النقيلية المنخفضة. يؤكد تحليل الصور والقياس الكمي والتحليل الإحصائي لبيانات الصورة أن الخلايا السرطانية عالية النقيلية يمكنها استعمار أنسجة الرئة بكفاءة.
في حين أن الخلايا النقيلية المنخفضة لا يمكن أن تنمو على الإطلاق. يسمح الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر عالي التكبير بتصور خلايا حمة الرئة بتفاصيل مكانية كبيرة مقارنة ب EGFP التي تعبر عن الخلايا السرطانية. وكذلك يسهل تحليل الهياكل الخلوية ، مثل هذه الميتوكوندريا.
اعتمادا على عدد الفئران المستخدمة ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بمعدات جراحية نظيفة ومعقمة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السرطان لاستكشاف تطور ورم خبيث في رئتي الفئران.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات زراعة الخلايا في المختبر والنشاف الغربي للإجابة على أسئلة إضافية حول تأثيرات الضربة القاضية الجينية أو العلاج بالعقاقير على الخلايا السرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص ورم خبيث رئوي. لا تنس أن العمل مع الخلايا السرطانية البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات مثل العمل في مختبر السلامة الحيوي ، يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة بروتوكول فحص النقائل الرئوية (PuMA)، الذي يسمح بتصوير ودراسة نمو خلايا ساركوما العظم النقيلي في أنسجة الرئة. يوفر هذا الأسلوب رؤى حول كيفية تكيف هذه الخلايا وتكاثرها في بيئة ثلاثية الأبعاد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- أبحاث النقائل
الخلفية
- ساركوما العظم النقيلي هو سرطان صعب دراستها.
- فهم سلوك الخلايا في بيئة الرئة أمر بالغ الأهمية.
- يوفر نموذج PuMA منصة مناسبة لمثل هذه الدراسات.
- توجد تحديات فنية في تنفيذ الفحص.
غرض الدراسة
- لتصوير نمو خلايا ساركوما العظم النقيلي.
- للتحقيق في تكيف الخلايا وبقائها في أنسجة الرئة.
- لتعزيز فهم نقائل ساركوما العظم.
الطرق المستخدمة
- قسطرة القصبة الهوائية من أجل نفخ الرئة.
- حقن خلايا الورم في الوريد الذيلي.
- استخدام الفحص الفلوري واسع المجال أو مجهر المسح بالليزر الكونفوكالي.
- الالتزام بالإرشادات المؤسسية لإيداع الحيوانات.
النتائج الرئيسية
- تحقيق التصوير المباشر لنمو الخلايا النقيلي.
- رؤى حول تكاثر الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد.
- تحديد آليات البقاء الرئيسية في الرئة.
- تسليط الضوء على التحديات التقنية للباحثين الجدد.
الاستنتاجات
- يعتبر فحص PuMA أداة قيمة لدراسة نقائل ساركوما العظم.
- يوفر رؤى حاسمة حول السلوك النقيلي.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه المنهجية لفهم أفضل لنقائل السرطان.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The pulmonary metastasis assay (PuMA) enables direct visualization of osteosarcoma cell colonization in lung tissue, providing a physiologically relevant model for evaluating metastatic potential and therapeutic intervention. This ex vivo system supports mechanistic de-risking by allowing real-time assessment of tumor cell adaptation, survival, and proliferation in a three-dimensional microenvironment. It enhances predictive confidence in target validation and lead identification by linking phenotypic outcomes to drug effects in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how metastatic osteosarcoma cells adapt and survive in the lung microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of tumor cell behavior in a relevant tissue context.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in metastatic colonization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative image-based readouts of lesion area and number, enabling standardized assessment of metastatic growth across experimental conditions.
- Operational Value: Compatible with widefield and confocal fluorescence microscopy, allowing scalable imaging workflows for compound screening.
- Strategic Value: Supports assay readiness by generating reproducible, quantifiable outputs that can be used to evaluate anti-metastatic therapeutics over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using murine lung tissue to model the osteosarcoma metastatic niche, enabling study of microenvironmental interactions.
- Operational Value: Permits longitudinal imaging to assess dynamic changes in tumor growth and response to intervention.
- Strategic Value: Connects discovery-phase findings to preclinical validation by providing a bridge between in vitro models and in vivo metastasis.
Pipeline & Workflow Integration
The PuMA model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, offering a platform to prioritize candidates based on metastatic phenotype.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of how osteosarcoma cells colonize lung tissue and respond to microenvironmental cues.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as metastatic lesion area, which can be measured and compared across treatment groups using image analysis tools like ImageJ.
- Analytics: Generates measurable data on tumor cell proliferation and spatial distribution, supporting statistical analysis to confirm differences between high and low metastatic lines.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using intact lung explants to study gene function, promoter activity, and subcellular structures in metastatic cells.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for evaluating multiple therapeutic candidates or genetic modifiers in a consistent, standardized system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in metastatic potential through direct, visual confirmation of colonization.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, imaging parameters, and quantification protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanistic insight into anti-metastatic efficacy, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to inhibit colonization in a disease-relevant lung microenvironment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, tracheal cannulation, and agarose insufflation to maintain lung integrity.
- Depends on access to fluorescence microscopy systems (widefield or confocal) and image analysis software such as ImageJ for quantification.
- Necessitates standardization across teams in tissue slicing, plating, and imaging conditions to ensure comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cell lines or genetic backgrounds, particularly in defining single-cell thresholds for particle analysis.
- Limited by the technical complexity of lung dissection and insufflation, which may affect throughput and require training for consistent execution.
