تلفيق والتحقق من صحة نظام الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال مباشرة

الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تصنيع واستخدام رقائق السوائل الدقيقة مع أقطاب كهربائية مدمجة لقياسات المقاومة الكهربائية عبر البطانة أو عبر الظهارة ، أو قياسات TEER. يتضح ذلك باستخدام حاجز دموي دماغي في رقاقة السوائل الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأعضاء على الرقائق من خلال تمكين القياس المباشر لوظيفة الحاجز ، على سبيل المثال ، أنسجة الحاجز الدموي الدماغي باستخدام أقطاب كهربائية متكاملة.

الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أن الأقطاب الكهربائية يتم دمجها بسهولة في أنظمة Organ-on-Chip وأنه يمكن مقارنة نتائج ذلك بين الأنظمة المختلفة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التكنولوجيا نحو فهم وظيفة الحاجز الدموي الدماغي في الصحة والمرض ، واكتشاف الأدوية ، والطب الشخصي. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتوفير نظرة ثاقبة لوظيفة الحاجز الدموي الدماغي ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا في سياق أنظمة Organ-on-Chip الأخرى مثل Lung-on-Chip و Gut-on-Chip.

لبدء هذا الإجراء ، اخلطي 27 جراما من العامل الأساسي PDMS و 2.7 جرام من عامل المعالجة جيدا. ثم قم بإزالة الخليط في مجفف لمدة 45 دقيقة تقريبا لإزالة فقاعات الهواء. في هذه الأثناء ، قم بإعداد القالب لخليط PDMS السائل عن طريق لصق شريط شفاف حول القالب ، أو ضع القالب في حامل رقاقة مناسب.

يسكب مزيج PDMS منزوع الغاز على القالب. بعد ذلك ، قم بمعالجة خليط PDMS في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات واتركه ليبرد بعد ذلك. في غطاء التدفق المتقاطع ، اسحب PDMS المعالج من القالب.

قم بقص النسخة المتماثلة PDMS إلى أجزاء منفصلة للرقاقة العلوية والسفلية باستخدام خطوط القطع في PDMS. بعد ذلك ، قم بعمل أربعة ثقوب في الأجزاء العلوية باستخدام ثقب خزعة حاد بقطر ملليمتر واحد لتشكيل مداخل ومنافذ. قم بالثقب من الداخل إلى الخارج لمنع حطام PDMS من التجمع في الشريحة.

ثم قم بتغطية أجزاء الرقاقة بشريط شفاف لحمايتها من الغبار. بعد ذلك ، قم بقطع أغشية البولي كربونات من إدخالات الآبار إلى مربعات تبلغ مساحتها حوالي ثلاثة ملليمترات مربعة. بعد ذلك ، قم بتجميع غشاء مسامي خال من التسرب بين جزأين من PDMS من أجل تجميع جهاز من طبقتين متصل بغشاء مسامي.

تحقيقا لهذه الغاية ، قم بإعداد ملاط التولوين PDMS باستخدام 0.7 جرام من عامل قاعدة PDMS ، و 07 جرام من عامل المعالجة ، و 540 ميكرولتر من التولوين. قم بتدوير الهاون جيدا ، ثم قم بتدوير 200 ميكرولتر من الملاط على غطاء زجاجي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية للحصول على طبقة رقيقة وموحدة من الملاط. بعد ذلك ، انقل طبقة رقيقة من الملاط من الغطاء إلى الجزء السفلي من الشريحة باستخدام بكرة حبر.

ضع الجزء السفلي في طبق آمن للفرن ثم انقل الهاون إلى الجزء العلوي من الشريحة. باستخدام مجموعة من الملقط ، اغمس حواف الغشاء في الملاط المطلي بالمغزل وضعه بعناية في منتصف الجزء السفلي. بعد ذلك ، ضع الجزء العلوي بعناية في الجزء السفلي مع الانتباه إلى المحاذاة.

قم بتغطية مداخل الرقائق بشريط شفاف لمنع دخول الغبار إلى الرقاقة واخبزها على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. توخي الحذر مهم جدا في هذه الخطوة. لا تضغط على الرقاقة ولا تنزلق الجزء العلوي فوق الجزء السفلي لمنع الملاط من دخول القنوات وانسداد الغشاء.

لدمج الأقطاب الكهربائية في القنوات الجانبية ، قم بقطع سلك بلاتيني إلى قطع بطول سنتيمترين. بعد ذلك ، اغمرها في الأسيتون لمدة 30 دقيقة. ثم اشطفها بالماء والإيثانول واتركها حتى تجف.

في غطاء التدفق المتقاطع ، ضع شريحة على طبق بلاستيكي. أدخل أربعة أسلاك بلاتينية في قنوات القطب الكهربائي للرقاقة باستخدام زوج من الملقط ، وثنيها لأسفل على الطبق البلاستيكي لتمكين التثبيت على الطبق في الخطوة التالية. أدخل الأسلاك من 0.7 إلى ملليمتر واحد في قناة الثقافة بعد تقاطع القناة على شكل حرف T.

بعد ذلك ، ضع قطرة من الغراء القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية عند مدخل قناة القطب الكهربائي واسمح للغراء بملء القناة بواسطة قوى الشعيرات الدموية. بعد ذلك ، قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية ومعالجة الغراء عندما يصل إلى نهاية قناة القطب. تثبيت الأقطاب الكهربائية الأربعة المتكاملة على الطبق البلاستيكي باستخدام مادة لاصقة إيبوكسي مكونة من عنصرين.

بعد ذلك ، قم بتغطية الرقائق بشريط شفاف واخبزها على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين. دعهم يبردوا واحفظهم خاليا من الغبار حتى الاستخدام. لتغطية الرقائق لتعزيز ارتباط الخلية ، املأ القناتين أولا ب PBS قبل إدخال الكواشف.

تحقق تحت المجهر إذا كانت هناك أي فقاعات هواء في القنوات. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بإزالتها عن طريق التنظيف باستخدام PBS إضافي. بعد ذلك ، املأ كلتا القناتين ب 30 ميكرولتر من 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الفبرونيكتين البشري في PBS.

احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم اغسل الرقائق بوسط نمو البطاني واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بقياس TEER للرقائق الفارغة للتأكد من أن جميع الأقطاب الكهربائية على اتصال مباشر بالسوائل في القنوات.

للقيام بذلك ، خذ شريحة من الحاضنة واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق على الأقل. قم بإزالة أي سائل من الطبق البلاستيكي حول الأقطاب الكهربائية لمنع الجسور الكهربائية خارج الشريحة. بعد ذلك ، خذ طيف المعاوقة من 200 هرتز إلى ميغاهرتز واحد لكل مجموعة من قطبين ينتج عنه ستة أطياف مقاومة لكل شريحة في خمس إلى عشر دقائق ، والتي يمكن من خلالها تحديد TEER مباشرة.

تحقق مما إذا كانت أطياف المعاوقة لها المقادير والأشكال المتوقعة للتحقق من صحة قياس TEER. الآن ، قم بإعداد تعليق خلية ليتم وضعه في القناة العلوية عن طريق إزالة وسط الثقافة من قارورة مزرعة ذات طبقة أحادية متجمعة من خلايا hcMEC / D3. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS.

قم بإزالة PBS ثم أضف ملليلترين من 05 في المائة من التربسين EDTA واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق حتى تنفصل الخلايا عن قارورة الثقافة. بعد ذلك، قم بإلغاء تنشيط التربسين باستخدام وسط الاستزراع المكمل بنسبة 20 في المائة FBS. عد الخلايا واحسب عددها الإجمالي في التعليق.

وفي الوقت نفسه ، قم بالطرد المركزي لخلايا hcMEC / D3 بمعدل 390 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في الحجم المناسب لوسط نمو البطانة لينتج عنه تركيز خمسة ملايين خلية لكل مليلتر يتوافق مع كثافة بذر تبلغ 200 ألف خلية لكل سنتيمتر مربع في الشريحة. بعد ذلك، قم بإخراج 30 ميكرولترا من معلق الخلية المختلط جيدا ببطء في القناة العلوية وقم بإزالة الماصة من المدخل بحركة بطلاقة مع الاستمرار في ممارسة الضغط.

تحقق من كثافة البذر تحت المجهر. يجب تحقيق توزيع موحد للخلايا في جميع أنحاء القناة العلوية. ثم احتضان الرقائق عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد ذلك ، قم بإخراج أي خلايا غير متصلة بوسط الثقافة البطانية. ضع في اعتبارك أنه تتم مراقبة TEER خلال فترة الثقافة. هذه هي طيف المعاوقة التخطيطية النموذجي الذي يظهر حجم المعاوقة وتحول الطور مقابل تردد التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية على الرقائق بدون خلايا ومع الخلايا.

هناك أربع مناطق رئيسية تهيمن عليها السعة مزدوجة الطبقة في الأقطاب الكهربائية ، أو مقاومة وسط الثقافة ، أو مقاومة حاجز الخلية أو سعة غشاء الخلية. تشير منطقة الاهتمام إلى المكان الذي يمكن فيه تحديد مساهمة طبقة الخلية. وهذه هي صيغة حساب TEER من المقاومات المقاسة بين جميع المجموعات الستة للأقطاب الكهربائية الأربعة.

يظهر هنا متوسط TEER لأربعة BBBs على الرقائق خلال فترة الاستزراع التي استمرت ثلاثة أيام ، وتصل إلى هضبة 22 زائد أو ناقص 1.3 أوم سنتيمتر مربع. للمقارنة ، يتم تضمين بيانات الرقائق الفارغة ، والتي تظهر تباينا هامشيا وانحرافا عن صفر أوم سنتيمتر مربع في نفس الفترة مقارنة بالتباين في قيمة TEER للرقائق ذات الخلايا. كشفت النسخة المجهرية الفلورية للنوى الملطخة عن طبقة أحادية مستمرة من البطانة على كل من PDMS والغشاء في الموقع الموضح في الداخل.

كشف التألق المناعي عن وجود بروتين زونولا ضيق الوصلة يحجب أحدهما يشير إلى أن التقاطعات الضيقة الخاصة ب BBB بين الخلايا تؤدي إلى TEER المقاس. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتصنيع واستخدام الرقائق ذات الأقطاب الكهربائية المدمجة لقياسات TEER في الأعضاء على الرقائق. يمكن استخدام هذه التقنية في مجال أبحاث الحاجز الدموي الدماغي لدراسة التوصيل المباشر وخصائص المرض ، على سبيل المثال ، مرض الزهايمر.

بعد هذا الإجراء ، يمكن أيضا مراقبة وظيفة الحاجز لبطانة الدماغ المتمايزة عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المستحثة من الإنسان بحثا عن تطبيقات في الطب الشخصي.