تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden

تفيد هذه الدراسة أسلوبين مختلفين لتحليل الخلية الغزو والهجرة: مقايسة الدائرة Boyden و في المختبر الفيديو المستندة إلى مجهر التئام المقايسة. وصف بروتوكولات لهذه التجارب اثنين، وتتم مقارنة مزايا وعيوب.

الهدف العام من هذه التجربة هو الإبلاغ عن المقايسين المستخدمين لدراسة غزو الخلايا وهجرتها ومقارنتها ، ومقايسة غرفة Boyden ، ومقايسة الجرح الخدش المحسنة في المجهر الفيديو. يمكن أن تساعد هذه التجارب في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال دراسة الغزو والهجرة مثل اختيار الطريقة الأكثر صلة. الميزة الرئيسية لهذا الفحص المحسن للجروح الخدش القائم على الفحص المجهري بالفيديو في المختبر هي أنه يوفر مقارنة قابلة للتكرار ودقيقة بين ظروف العلاج.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تقيم هجرة الخلايا وغزوها ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مجالات الدراسة الأخرى مثل الشفاء أو تجديد الأنسجة. قم بإعداد خلايا SQ20B قبل 72 ساعة من اليوم الأول من الفحص عن طريق البذر مرتين في 10 إلى 1/6 خلايا في 25 مل من وسط الزراعة في قارورة مساحتها 175 سم مربع. اسمح للخلايا بالنمو إلى 80٪ من التقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية.

في اليوم الأول بعد التربسين وعد الخلايا ، قم بزرع الخلايا في قارورة مساحتها 25 سنتيمترا مربعا بكثافة خلية ستة أضعاف 10 إلى 1/5 خلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة لكل حالة ليتم تقييمها. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتجويع الخلايا عن طريق استبدال الوسط الموجود في كل قارورة بثلاثة ملليلتر من وسط مصل الأبقار الجنيني المنخفض.

تجويع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لفحص الغزو ، قم بإعداد غرف Boyden المطلية بعد 12 ساعة من بدء تجويع الخلايا. ضع كل غرفة Boyden في الطبق المصاحب.

أضف 500 ميكرولتر من وسط خلية التجويع إلى كل غرفة مغلفة. في اليوم التالي ، اليوم الثالث ، استخدم اللوحة المصاحبة لتحضير الجاذب الكيميائي. املأ كل بئر من اللوحة المصاحبة المكونة من 24 بئرا ب 750 ميكرولتر من الوسط الكامل مع 10٪ FBS والهيدروكورتيزون والبنسلين والستربتومايسين.

انقل الحجرة العلوية إلى اللوحة المصاحبة المملوءة مسبقا مع الحرص على تجنب الفقاعات. لفحص الغزو ، قم بإزالة 450 ميكرولتر من وسط الاستزراع بعناية من كل غرفة Boyden. بعد التربسين وعد خلايا SQ20B الجائعة ، قم بالبذور ثلاث مرات 10 إلى 1/4 خلايا في 500 ميكرولتر من وسط BSA 0.1٪ مما يعطي تخفيفا نهائيا ستة أضعاف 10 إلى 1/4 خلايا لكل مليلتر.

ضع غرفة Boyden في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم الرابع ، قم بإزالة كل ملحق من اللوحة المصاحبة وقم بإزالة الخلايا بعناية من الغرفة العلوية باستخدام قطعة قطن. بعد ذلك ، قم بإصلاح وصمة عار كل ملحق على حدة للحصول على تلوين May-Grunwald Giemsa باستخدام مجموعة تلطيخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

إجراء التحليل المجهري في اليوم الخامس. أدخل اللوحة المصاحبة مع الإدخالات على مجهر تباين الطور 20X واحسب كل خلية مهاجرة في الجزء السفلي من الغشاء. قبل 72 ساعة من اليوم الأول من بذرة الفحص مرتين 10 إلى خلايا 1/6 SQ20B في 25 مل من وسط الثقافة في قارورة مساحتها 175 سم مربع والسماح للخلايا بالنمو إلى 80٪ من التقاء الخلية.

في اليوم الأول بعد التربسين وعد الخلايا ، قم بإنشاء عينة مخففة مسبقا من خلايا SQ20B بكثافة أربعة في 10 إلى 1/5 خلايا لكل مليلتر. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئرا لإعطاء كثافة نهائية أربعة في 10 إلى 1/4 خلايا لكل 100 ميكرولتر في كل بئر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية واترك الخلايا تلتصق باللوحة لمدة 12 إلى 16 ساعة.

في اليوم التالي ، خذ اللوحة إلى غطاء المحرك للجرح باستخدام جهاز جرح تجاري. قم بإزالة الجزء العلوي من صانع الجرح وضعه في محلول قارب الغسيل. أدخل اللوحة في حامل لوحة القاعدة وقم بإزالة غطاء اللوحة.

استبدل كتلة الدبوس عن طريق توجيه المسامير الخلفية لكتلة الدبوس في الفتحات الخلفية للوحة القاعدة. ادفع مع الاستمرار الذراع الأسود وارفع كتلة الدبوس مع الاستمرار في الضغط على الذراع الأسود لأسفل. باستخدام ماصة ذات طرف مخروطي مكيف ، قم بإزالة الوسط على الفور من كل بئر ، مع الحرص على عدم لمس الجرح.

اغسل الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من وسط الخلية الدافئ إلى 37 درجة مئوية إلى كل بئر. بعد الغسيل الثاني ، استخدم ماصة ذات طرف مخروطي مكيف لشفط وسط الخلية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط المحدد لكل حالة معالجة إلى كل بئر مع التأكد من تجنب تكوين أي فقاعات في الآبار.

ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا في الرف المعدل لمجهر الفيديو. باستخدام برنامج مجهر الفيديو ، جدول عمليات المسح الضوئي في صورة واحدة لكل بئر. وبالنسبة لتجربة غزو الهجرة، يلزم فاصل زمني مدته ساعتان كحد أقصى.

إذا كان الهدف من التجربة هو إنتاج مقطع فيديو ، يفضل فاصل زمني مدته 30 دقيقة كحد أقصى. مراقبة وفحص هجرة الخلايا لمدة لا تقل عن 24 ساعة وحتى خمسة أيام باستخدام قناع خلية مناسب تم تكييفه مع كل نوع من أنواع الخلايا لتحليل هجرة الخلايا. للحصول على قناع خلية يتكيف مع كل خط خلية ، قم بإنشاء تعريف معالجة خلية من البرنامج باستخدام مجموعة صور خلية معينة.

تتبع المنحنيات وتصدير البيانات إلى جدول بيانات يمكن استخدامه لتحليل النتائج ومقارنتها. للتحضير لغزو الخلية ، قم بفحص خلايا البذور SQ20B بنفس الطريقة الموضحة في مقايسة هجرة الخلايا ، واحتضان اللوحة المكونة من 96 بئرا في الحاضنة. في اليوم الثاني من الفحص ، قم بإعداد المصفوفة خارج الخلية.

بإذابة المصفوفة عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل قبل الاستخدام وتأكد من عدم وجود مجاميع مرئية. قم بتبريد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد لمدة خمس دقائق. قم بتخفيف المصفوفة بأطراف مخروطية مبردة مسبقا إلى أربع درجات مئوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا مع وسط الخلية المبرد إلى أربع درجات مئوية للحصول على تركيز نهائي يبلغ 300 ميكروغرام لكل ملليلتر.

احتفظ بأنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات المصفوفة المخففة مسبقا في الثلاجة عند أربع درجات مئوية. استرجع اللوحة المكونة من 96 بئرا من الحاضنة. تحت غطاء المحرك ، قم بعمل الجرح باستخدام جهاز الجرح التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة كما هو موضح سابقا.

استخدم ماصة ذات طرف مخروطي مكيف لإزالة الوسط على الفور من كل بئر واحرص على عدم لمس الجرح. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من وسط الخلية الدافئ إلى 37 درجة مئوية. بعد الغسيل الثاني ، ضع الطبق على الجليد لمدة خمس دقائق لموازنة درجة حرارته.

قم بإزالة الوسط البارد من كل بئر مع الحرص على الماصة بعناية من الحافة وتجنب لمس الجرح. باستخدام أطراف مخروطية مبردة مسبقا عند أربع درجات مئوية ، أضف 50 ميكرولترا من المصفوفة المخففة مسبقا إلى كل بئر. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الخلية المكيف إلى كل بئر كما هو موضح لكل حالة علاجية. ضع اللوحة في الرف المعدل في مجهر الفيديو. بعد ذلك قم ببرمجة عمليات المسح وإجراء تحليل المجهر بالفيديو كما هو موضح لمقايسة هجرة الخلايا.

عرض النتائج التمثيلية لغشاء Boyden بعد تثبيت الخلية. يحتوي الغشاء دون المستوى الأمثل على مجموعات خلايا على الجانب العلوي من الغشاء ونتائج غير قابلة للتفسير. في المقابل ، يحتوي الغشاء الأمثل على خلايا قابلة للعد في الجزء السفلي من الغشاء ملطخة باللون الأزرق.

توضيح النتيجة المثلى لمقايسة الجرح الخدش من خلال هذه الصور لالتئام الجروح في ساعة الصفر و 15 ساعة و 30 ساعة. معايير تجربة الجودة هي الجرح الخطي ، وعدم ملاحظة شظايا الخلية في الجرح ، والتقاء الخلايا الأمثل. 90٪ التقاء هو كثافة الخلايا المثلى لمقايسة التئام الجروح كما هو موضح في اللوحة A.تظهر اللوحة C مثالا على كثافة الخلايا المنخفضة وتظهر اللوحة B مجموعات الخلايا الناتجة عن عدم كفاية غسل حبيبات الخلية.

هذا التمثيل الرسومي لالتئام الجروح الذي تم الحصول عليه باستخدام برنامج مجهر الفيديو القياس الكمي لمعلمات التقاء خلايا الجرح وفقا للوقت لأربعة شروط علاجية. لوحظ أن العلاج المركب يقلل بشكل كبير من هجرة الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم عملية هجرة الخلايا والغزو.