البروتوكول خطوة واحدة لتقييم الوضع من موت الخلايا كلونوجينيك الإشعاع بالفحص المجهري Fluorescence

الهدف العام من هذا الاختبار هو تقييم الأنماط الرئيسية لموت الخلايا المستكلة الناجمة عن الإشعاع المؤين بناء على الأشكال المميزة للنوى الملطخة ب DAPI. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الإشعاع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية السريعة والفعالة من حيث التكلفة هي أنه يمكن تقييم الأنماط الرئيسية لموت الخلايا المستنسخة الناجمة عن الإشعاع المؤين في وقت واحد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في بيولوجيا الإشعاع لتقييم موت الخلايا المستنسخة الناجم عن الإشعاع لأن فحوصات مختلفة مطلوبة لتقييم كل نمط من أنماط موت الخلايا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أجرينا فحصا واسع النطاق لموت الخلايا المستنسخة الناجم عن الإشعاع باستخدام خطوط خلايا متعددة وجرعات إشعاعية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الإشعاع ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل العلاج الكيميائي للسرطان.

وسيكون متعاوننا أتسوشي شيباتا في عرض هذا الإجراء. ابدأ بتعقيم مشرط بمنشفة ورقية مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم المشرط لوضع زلة غطاء في طبق ثقافة خلية 35 ملم.

إلى طبق الثقافة مع زلة الغطاء ، أضف ملليلتر واحد من وسط الاستزراع. الآن أمسك برفق مركز زلة الغطاء باستخدام ملقط معقم واستنشق وسط الثقافة من الطبق تماما. بعد ذلك ، قم بإعداد معلق خلية بسعة ثلاثة ملليلتر في وسط الثقافة في أنبوب سعة 15 ملليلترا.

أضف تعليق الخلية إلى طبق الثقافة. واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكد من أن الخلايا متصلة بزلة الغطاء وأنها حية من خلال فحصها تحت مجهر تباين الطور المقلوب.

الآن تشعيع الطبق بستة إشعاعات بالأشعة السينية الرمادية. بعد التشعيع ، احتضان الخلايا في حاضنة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الآن خذ الخلايا من الحاضنة واستنشق وسط الثقافة من طبق الثقافة.

قم بقص طرف ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر على بعد حوالي خمسة ملليمترات من النهاية باستخدام المقص. واستخدمه لإضافة مليلتر واحد من محلول التثبيت إلى طبق الثقافة. ضع محلول التثبيت على طول جدران طبق الثقافة لتقليل الضرر الذي يلحق بالخلايا.

ثم انقل طبق الثقافة هذا إلى طبق ثقافة مربع ورجه برفق لتوزيع محلول التثبيت بالتساوي على زلة الغطاء. بعد ذلك ، احتضن الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق محلول التثبيت من الطبق.

أضف الآن ملليلترين من PBS على طول جدران الطبق. ثم استنشق برنامج تلفزيوني. للتحضير لتلوين DAPI ، أضف خمسة ميكرولترات من كاشف تلطيخ DAPI على شريحة زجاجية.

ثم قم بإزالة زلة الغطاء من الطبق باستخدام مشرط. واستنزاف PBS الزائد على زلة الغطاء عن طريق لمس حافة زلة الغطاء بمنشفة ورقية. الآن قم بتركيب زلة الغطاء رأسا على عقب على قطرة كاشف تلطيخ DAPI على الشريحة الزجاجية بحيث تتعرض الخلايا لكاشف تلطيخ DAPI.

أخيرا ، افحص الخلايا الملطخة تحت مجهر مضان مزود بمرشح DAPI. يتم عرض الأشكال النووية في كل من الأنماط الثلاثة لموت الخلايا. تظهر الخلايا المبرمجة ذات النوى المكثفة.

لوحظت فصوص متعددة في نوى الخلايا التي تمر بكارثة انقسامية. ينظر إلى الخلايا التي تخضع للشيخوخة على أنها تظهر بؤر تغاير الكروماتين المرتبطة بالشيخوخة. يتم عرض ملاحظة مقارنة للنوى والنوى المشععة الوهمية المشععة بست أشعة سينية رمادية.

تشير الدوائر إلى النوى التي تخضع لموت الخلايا المبرمج ، وتشير الأسهم إلى النوى التي تمر بكارثة انقسامية. يتم عرض تقييم حوالي 300 نواة معرضة للإشعاع مقارنة بالوهمية. ينظر إلى تشعيع الأشعة السينية الرمادي الستة على أنه يسبب كارثة انقسامية بشكل متكرر عند حوالي 25٪ يليه موت الخلايا المبرمج عند حوالي 5٪ وأحداث شيخوخة نادرة جدا.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم إتلاف الخلايا عن طريق تطبيق المحاليل مباشرة على زلات الغطاء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تحليل قياس التدفق الخلوي أو بروتينات علامة موت الخلية ، بالإضافة إلى تلطيخ بيتا جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة لتقييم الشيخوخة لفهم كل نمط من أنماط موت الخلايا المستكلة.