الكشف عن الطفرات النادرة في كتدنا باستخدام تسلسل الجيل القادم

الهدف العام من هذه التقنية هو اكتشاف الطفرات ذات التردد المنخفض في الورم المنتشر أو ctDNA لتزويد الأطباء السريريين بأداة قوية لتشخيص الأورام ومراقبة ديناميكيات الورم استجابة للعلاج. يمكن أن تساعد طريقة اختبار ctDNA في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول أنواع الطفرات التي يحملها المريض مثل التباين من النوع النووي الفردي ، وحذف الإدراج ، واختلاف رقم النسخ ، والتباين الهيكلي. الميزة الرئيسية لهذا التقني هي الحساسية العالية والخصوصية التي تكشف بدقة عن الطفرات منخفضة التردد في ctDNA.

سيوضح الإجراءات يوليانغ يانغ ، فني من مختبري. للبدء ، اسحب 10 مل من الدم المحيطي في أنبوب تجميع واقلب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل ست إلى ثماني مرات لخلط المحتويات. قم بتخزين عينات الدم في أنابيب التجميع عند درجة حرارة تتراوح من ست إلى 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.

جهاز الطرد المركزي أنبوب التجميع عند 1 ، 600 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم استخدم ماصة التخلص لنقل المادة الطافية أو البلازما من الأنبوب إلى أربعة أنابيب طرد مركزي نظيفة سعة ملليلترين تحمل علامة مناسبة دون إزعاج الحبيبات. استخدم ماصة التخلص النظيفة لنقل مليلتر واحد من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مسمى ملليلترين بشكل مناسب.

قم بتخزين الخلايا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو أكثر برودة قبل عزل الجينوم أو الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للبلازما عند 1،600 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم انقل البلازما لتنظيف أنابيب الطرد المركزي المسماة بشكل صحيح على أنها بلازما ، مع ترك ما يقرب من 0.1 ملليلتر من الحجم المتبقي في الأسفل لتجنب التلوث.

يجب تجنب الطبقة المصفرة من البلازما أثناء عملية الفصل. خلاف ذلك ، قد تؤدي شظايا الحمض النووي الكبيرة المستخرجة من الخلايا إلى تخفيف ctDNA وتؤثر على حساسية الاختبار. باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا ، قم بعزل cfDNA من ثلاثة ملليلتر من البلازما المجمعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

ثم أيضا باستخدام مجموعة ، قم بعزل gDNA من 200 ميكرولتر من خلايا الدم البيضاء باتباع تعليمات الشركة المصنعة. لتجزئة عينة التحكم في gDNA عن طريق الصوتنة ، قم بإعداد ميكروغرام واحد من عينة gDNA في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA في أنبوب صوتنة نظيف. اضبط برنامج الصوتنة على 30 ثانية وإيقاف التشغيل لمدة 30 ثانية لمدة 12 دورة لما مجموعه 12 دقيقة.

بعد التأكد من أن المنتج يحتوي على 200 إلى 250 قطعة زوج أساسي ، انقل جميع منتجات التجزئة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 150 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي واحتضان العينة لمدة خمس دقائق لتحديد الأجزاء الصحيحة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 30 ثانية وقم بإزالة المادة الطافية. ثم مع الاحتفاظ بالأنبوب على الرف ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ لغسل الخرز.

احتضن الخرزات لمدة 30 ثانية قبل إزالة المادة الطافية وكرر الغسيل. احتفظ بالأنبوب على الرف مع فتح الغطاء لتجفيف الخرز في الهواء. ثم قم بمسح شظايا الحمض النووي بإضافة 32 ميكرولتر من 10 ملليمولار Tris-HCL إلى الخرز.

لتنفيذ تفاعل الإعداد النهائي باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، إلى أنبوب معقم خال من النوكلياز ، أضف سبعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتفاعل ، وثلاثة ميكرولترات من مزيج الإنزيم ، و 30 نانوغراما من cfDNA ، والماء المقطر بشكل مضاعف لحجم إجمالي يبلغ 60 ميكرولترا. في أنبوب منفصل ، أضف نفس المكونات ولكن باستخدام ميكروغرام واحد من gDNA بدلا من cfDNA. يحتضن الخليط في دورة حرارية على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة متبوعا ب 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة دون تسخين الغطاء.

مباشرة بعد الحضانة ، أضف 30 ميكرولترا من مزيج الربط الرئيسي ، وميكرولتر واحد من محسن الربط ، وأربعة ميكرولترات من محول التسلسل الفريد إلى الأنبوب. احتضان التفاعل في التدوير الحراري عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة دون تسخين الغطاء. دوامة لإعادة تعليق الخرز المغناطيسي وترك الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.

ثم أضف 87 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية المعلقة إلى تفاعل الربط. تخلط جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ثم احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد غسل الخرزات وتجفيفها بالهواء ، قم بإزالة هدف الحمض النووي من الخرزات بإضافة 20 ميكرولتر من 10 ملليمولار Tris-HCL.

أضف 20 ميكرولترا من شظايا الحمض النووي المربوطة بالمحول ، وخمسة ميكرولترات من برايمر الفهرس i7 ، و 25 ميكرولترا من المزيج الرئيسي لتضخيم المكتبة ، والماء المقطر بشكل مضاعف يصل حجمه الإجمالي إلى 50 ميكرولترا. PCR تضخيم المحول المرتبط ب cfDNA أو gDNA. ثم أضف 45 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المعلق إلى الحمض النووي المخصب ب PCR.

امزج العينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل واحتضانها لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية وغسل الخرزات ، استخدم 30 ميكرولترا من 10 مللي مولار Tris-HCL لمسح شظايا الحمض النووي بالمحولات. لإجراء التقاط الحمض النووي المستهدف ، في أنبوب معقم ، قم بحظر العينة عن طريق إضافة 1.5 ميكروغرام من مكتبات التجميع ، وثمانية ميكرولترات لكل من كتلة P5 100P و P7 كتلة 100P ، وخمسة ميكرولترات من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من الحمض النووي الواحد.

جفف محتويات الأنبوب باستخدام مكثف فراغ ضبط على 60 درجة مئوية. قم بتهجين مجسات التقاط الحمض النووي مع المكتبة عن طريق إضافة 8.5 ميكرولتر من مخزن التهجين 2X ، و 2.7 ميكرولتر من محسن التهجين ، و 1.8 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج الخالي من النوكلياز. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل واحتضانه في الخلاط الحراري على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم أضف على الفور أربعة ميكرولترات من المسبار المخصص. احتضان العينات في خلاط حراري عند 65 درجة مئوية مع تسخين الغطاء إلى 75 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. احتضان الحمض النووي المستهدف المهجن بخرز الستربتافيدين ثم اغسل الخرزات لإزالة الحمض النووي غير المرتبط.

استخدم المجموعة التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للحصول على 20 ميكرولترا نهائيا من الخرز المعلق مع شظايا الحمض النووي الملتقطة. يجب أن تكون خطوة غسل الحمض النووي غير المرتبط من حبات الستربتافيدين سريعة. خلاف ذلك ، قد تتأثر كفاءة التقاط الحمض النووي المستهدف.

قم بتضخيم شظايا الحمض النووي الملتقطة عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تجارية تحتوي على اثنين من قليل النوكليوتيدات الأساسية الدقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أخيرا ، أضف 45 ميكرولترا من الخرز المعلق مباشرة إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل وإثراء شظايا الحمض النووي المستهدف المضخم المرتبطة بالخرز عن طريق الشطف ب 30 ميكرولتر من 10 مللي مولار Tris-HCL. تحديد الأجزاء وإجراء التسلسل وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.

يوضح هذا الجدول كيف يحسن ER-seq عمق التغطية بنسبة 23٪ مقارنة بالطريقة التقليدية. ويرجع ذلك إلى استعادته الفعالة لجزيئات cfDNA ، مما يعزز بشكل كبير تحليل الطفرات النادرة. من الواضح أيضا أن محولات التسلسل الفريدة المستخدمة في ER-seq تتيح سهولة التمييز بين الازدواجية الطبيعية والناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

كما هو مفصل في هذا الجدول حول نتائج الاستدعاء ، كان التحليل المستند إلى ER-seq متسقا بنسبة 100٪ لاكتشاف EGFR pL858R وكان تكرار الكشف أعلى قليلا عند مقارنته بالتحليل التقليدي. الأهم من ذلك ، أن تحليل ER-seq مكن من اكتشاف طفرات أخرى منخفضة التردد نسبيا بما في ذلك EGFR pT790M التي لم يتم التعرف عليها من خلال التحليل التقليدي بسبب ضوضاء الخلفية العالية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 48 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب فقدان كمية منخفضة جدا من cfDNA أثناء الاستخراج وإعداد المكتبة وغسل الخرز بعد التهجين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع ctDNA من المريض وإعداده واستهدافه بناء على التحديد الفريد للتسلسل. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخزعة السائلة لاستكشاف ممارسات أفضل في اتخاذ قرارات العيادة.