Name: الكشف عن الطفرات النادرة في كتدنا باستخدام تسلسل الجيل القادم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: اكتشف تقنية ER-Seq للكشف عن الطفرات النادرة في ctDNA باستخدام تصحيح الخطأ ثنائي الاتجاه. توفر هذه الطريقة حساسية وخصوصية عالية لتشخيص الأورام ومراقبة الاستجابة العلاجية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم هذا العمل معهد جينيبلوس – بكين.

وتم الحصول على عينات الدم وعينات الورم وفقا لبروتوكول أقرته "لجنة الأخلاقيات لشعب جامعة بكين" &#39; s المستشفى. تم الحصول على الموافقة الخطية من المرضى لاستخدام العينات الخاصة بهم. تم فحص المشاركين وفقا للمعايير التالية: أنثى، متقدمة عدم الصغيرة "سرطان الرئة"، طفرة p.L858R EGFR وتبين حسب "تسلسلها سانغر" السابق، تطور المرض عقب الدورة اثنين من EGFR استهدفت العلاج مع ارلوتينيب، و ER-Seq الذي طبق على كتدنا لتحليل قضية المقاومة وإيجاد أدوية جديدة للهدف-
 1-"استخراج الحمض النووي" من "الدم المحيطي" كفدنا والحمض النووي (جدنا) <ol><li>وجمع 10 مل دم المحيطي في أنبوب جمع، وعكس بلطف صعودا وهبوطاً 6-8 مرات إلى المزيج. تجنب إمالة الخلية. يمكن تخزين عينات الدم في أنبوب جمع في 6-37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.</li>
	<li>الطرد المركزي أنبوب جمع في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في 1600 (±150) × غ.</li>
	<li>نقل المادة طافية (البلازما) من أنبوب جمع بأربعة نظيفة 2 مل مناسب المسمى أنابيب الطرد المركزي باستخدام بيبيت المتاح دون الإخلال بطبقة بيليه (خلايا الدم البيضاء).</li>
	المسمى <li>Transfer1 مل من الخلايا باستخدام بيبيت نظيفة المتاح لمل 2 شكل مناسب أنبوب الطرد المركزي. يمكن أن تكون الخلايا المخزنة في-20 درجة مئوية أو أبرد قبل الخطوة 1.8.</li>
	<li>الطرد المركزي البلازما (من الخطوة 1، 3) 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، و 16000 (±150) × غ.</li>
	<li>نقل البلازما لتنظيف أنابيب الطرد المركزي التي توصف بشكل صحيح &#34; البلازما &#34;، اترك مل ~0.1 من وحدة التخزين المتبقية في الجزء السفلي لتجنب التلوث. تخزين البلازما في-80 درجة مئوية حتى الخطوة 1.7.</li>
	<li>استخدام 3 مل بلازما من الخطوة 1، 6 لعزل كفدنا (يحتوي على كتدنا) باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً، بعد الشركة المصنعة &#39; تعليمات s.</li>
	<li>استخدام 200 ميليلتر من خلايا الدم البيضاء من الخطوة 1، 3 عزل جدنا باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً، بعد الشركة المصنعة &#39; تعليمات s- 
	ملاحظة: كل كفدنا وجدنا يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	<li>تطبيق ضوابط الجودة المختلفة كفدنا وجدنا (الجدول 2). تنفيذ مراقبة الجودة بطريقة موحدة بيواناليزير لتحديد مستويات التدهور عينة و/أو تلوث جدنا. تحليل ذروة نوعية استخراج كفدنا يجب أن تظهر مشابهة الشكل 1- 
	ملاحظة: أقصى حجم كفدنا هو حوالي 170 هناك علما أن زيادة كمية الحمض النووي سيؤدي إلى مكتبة نوعية أعلى للكشف عن الطفرات النادرة في كفدنا فعالة. ونحن نوصي باستخدام على الأقل 30 نانوغرام كفدنا (000 30 نسخة)-</li>
</ol> 2. إعداد مكتبة ملاحظة: فيما يتعلق بمكتبة قاعدة البناء على الحمض النووي مجزأة، كفدنا موجود في شظايا مع ذروة حجم ~ 170 شركة بريتيش بتروليوم وبالتالي لا تحتاج إلى أن تكون مجزأة.
نموذج <ol><li>يفتت عنصر التحكم (جدنا) التي سونيكيشن للحصول على 200-250 شركة بريتيش بتروليوم الشظايا.
	<ol><li>إعداد 1 ميكروغرام من عينة جدنا في 100 ميليلتر تريس يدتا المخزن المؤقت في أنبوب نظيف sonication.</li>
		<li>تعيين البرنامج sonication ك 30 s s على و 30 قبالة لدورات 12 لإجمالي 12 دقيقة</li>
		<li>سونيكيشن، وبعد التأكد من المنتج (5 ميليلتر) يحتوي على 200-250 شركة بريتيش بتروليوم الشظايا عن طريق تشغيل تحليل مع 2% [اغروس] هلام.</li>
		<li>نقل جميع تجزئة المنتجات إلى أنبوب 1.5 مل جديدة واحتضان مع 150 ميليلتر من حبات المغناطيسية لمدة 5 دقائق لتحديد الأجزاء الصحيحة.</li>
		<li>إزالة المادة طافية عن طريق وضع الأنبوب في رف مغناطيسية لمدة 30 س.</li>
		أغسل <li>الخرز مع 200 ميليلتر من الإيثانول 80% (طازج) مع أنبوب البقاء على الرف المغناطيسية. احتضان لمدة 30 ثانية قبل إزالة المادة طافية. كرر مرة واحدة.</li>
		<li>الهواء الجاف الخرز مع غطاء أنبوب مفتوحة مع البقاء على الرف المغناطيسية. تجنب الخرز أوفيردريد للتأكد من أن يسترد الحمض النووي الهدف جيدا. الوت شظايا من الحمض النووي من الخرز بإضافة ميليلتر 32 10 مم تريس-HCl (pH 8) الخرز لحل الشظايا من الحمض النووي تبع القياس الكمي مطيافية الأشعة فوق البنفسجية/Vis. 
		ملاحظة: على الأقل 200 نانوغرام المسبق للتجارب التالية-</li>
	</ol></li> <li>"نهاية الإعدادية رد فعل" ملاحظة: تتبع الشركة المصنعة &#39; s التعليمات وتعديلها حسب الحاجة. استخدام 30 نانوغرام من كفدنا؛ و 1 ميكروغرام من جدنا كعنصر التحكم.
	نغ <ol><li>ميليلتر 7 إضافة رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميليلتر من هذا المزيج الإنزيم، 30 من كفدنا في أنبوب خالية نوكلاس عقيمة، وإضافة ddH 2 س إلى إجمالي حجم 60 ميليلتر. في أنبوب منفصل، أضف المكونات المذكورة أعلاه ولكن مع 1 ميكروغرام من جدنا بدلاً من كفدنا-</li>
		<li>ميكس واحتضان المخلوط في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في ثيرموسيكلير دون غطاء ساخنة. الشروع فورا في الخطوة التالية-</li>
	</ol></li> <li>"ربط محول" <ol><li>إضافة 30 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط و 1 ميليلتر من محسن ربط ميليلتر 4 محولات تسلسل فريدة من نوعها إلى الخليط من الخطوة 2، 2-</li>
		<li>إينكوباتي في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في ثيرموسيكلير دون غطاء تسخينها.</li>
		<li>دوامة ريسوسبيند المغناطيسي الخرز وترك الخرز في درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة على الأقل قبل الخطوة التالية-</li>
		<li>إضافة ميليلتر 87 من الخرز المغناطيسي ريسوسبينديد إلى الخليط المذكور آنفا؛ ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً واحتضان ثم في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5</li>
		<li>المياه والصرف الصحي والهواء الجاف الخرز كما هو موضح في "الخطوة 2، 1"-</li>
		<li>الوت الهدف الحمض النووي من الخرز بإضافة 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl (pH 8)-</li>
	</ol></li> <li>شظايا من "الإثراء للحمض النووي" متصلة بمحول <ol><li>إضافة 20 ميليلتر من الحمض النووي المحول متصلة الأجزاء، 5 ميليلتر من الفهرس التمهيدي/i7 (2.5 ميليلتر التمهيدي-P7 (10:00 م) و 2.5 ميليلتر من التمهيدي-P5 (10:00 م)، لأغراض التسلسل)، 25µL من مكتبة التضخيم مزيج الرئيسي، و ddH 2 س إلى إجمالي حجم 50 ميليلتر.</li>
		<li>بكر تضخيم الحمض النووي المحول متصلة ودورة الحرارية كما يلي: تمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية ل 45 s، تليها 8 دورات (كفدنا) أو 4 دورات (جدنا) من الصلب درجة مئوية لمدة 15 ق، 65 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 30 s) ، وملحق نهائي في 72 درجة مئوية ل 60 s، ثم عقد درجة حرارة 4 درجة مئوية.</li>
		<li>ميليلتر 45 إضافة لتعليق الخرز المغناطيسي للحمض النووي المخصب PCR للحصول على شظايا المكتسبة.</li>
		<li>"الدنا الوت" شظايا مع محولات في 30 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl (pH 8)-</li>
	</ol></li> <li>"مراقبة الجودة في مكتبة" <ol><li>تتبع الشركة المصنعة &#39; بروتوكول s للمجموعة التجارية لقياس محول متصلة تركيز الحمض النووي. استخدام بيواناليزير تحديد نوعية الحمض النووي-</li>
	</ol></li></ol> 3. استهدفت القبض على الحمض النووي ملاحظة: إثراء الهدف أجرى باستخدام التقاط تسلسل مخصص-مسبار الذي صمم خصيصا لمنطقة تخصيب هدف 1021 كيلو بايت تغطي الطفرات المعروفة المرتبطة بورم برنامج التشغيل من 12 أنواع مختلفة من الأورام. تعديلات على الشركة المصنعة &#39; بروتوكول s هي مفصلة في الخطوات التالية-
<ol><li>وقف <ol><li>إضافة 1.5 ميكروغرام تجميع المكتبات (الحد الأقصى لعدد من المكتبات إلى تجمع كفدنا هو 6، جدنا هو 20) من الخطوة 2، 8 ميليلتر من P5 Block(100P) و 8 ميليلتر من P7 Block(100P) 5 ميليلتر من "الحمض النووي" عند استخدام سرير-1 (1 ميكروغرام/ميليلتر) في أنبوب عقيم. الجاف لمحتويات الأنبوبة باستخدام مركز فراغ في 60 ° C.</li>
	</ol></li> <li>هيبريديزي القبض على الحمض النووي تحقيقات مع المكتبة.
	<li>أضف المكونات التالية إلى الأنبوب من الخطوة 3.1: 8.5 ميليلتر 2 X التهجين العازلة، ميليلتر 2.7 محسن التهجين، وميليلتر 1.8 خالية نوكلاس ddH 2 أولمبيك</li> <ol>
		<li>مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان في ثيرموميكسير عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10</li>
		<li>عقب الحضانة، فورا إضافة 4 ميليلتر "التحقيق مخصص". احتضان عينات في cycler حرارية في 65 & #176؛ ج مع غطاء تسخينها إلى 75 درجة مئوية ل 4 h.</li>
	</ol></li> <li>الحمض النووي وشظايا التقاط <ol><li>احتضان الهدف المهجن الحمض النووي مع الخرز streptavidin متبوعاً بالغسيل الخرز لإزالة الحمض النووي غير منضم. استخدم هذه المجموعة التجارية وفقا للشركة المصنعة &#39; s التعليمات للحصول على ميليلتر 20 نهائي من حبات حراكه مع الحمض النووي تم التقاطها وشظايا.</li>
	</ol></li> <li>تضخيم الحمض النووي تم التقاطها وشظايا <ol><li>"بكر أداء" التجاري باستخدام طقم مع 2 ميكرومتر العمود الفقري النوكليوتيد، وفقا للشركة المصنعة &#39; تعليمات s.</li>
		<li>تفاعل PCR عند اكتمال، إضافة ميليلتر 45 من الخرز مع وقف التنفيذ مباشرة إلى المنتج بكر وإثراء الشظايا من الحمض النووي الهدف تضخيم ملزمة الخرز شطف مع 30 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl (pH 8)-</li>
	</ol></li> <li>كمياً الشظايا من الحمض النووي مع مجموعة أدوات القياس الكمي المكتبة وتحديد طول جزء متوسط من بيواناليزير ( الشكل 2).</li></ol>
 4-التسلسل <ol><li>تسلسل متعدد المكتبات باستخدام 75 شركة بريتيش بتروليوم نهاية الاقتران يعمل على المنظم benchtop 18 h. مجموع البيانات المنتجة هو يصل إلى 60 غيغا بايت، و 15 ز مطلوبة من أجل كفدنا عينة المريض وز 1 عنصر تحكم نموذج جدنا.</li></ol>
 5-سير العمل في تحليل البيانات ملاحظة: الرقم 3 يعرض عملية تحليل البيانات وتدفق العمل العام. تظهر المعلمات تحليل البيانات والأوامر أدناه.
<ol><li>تصفية يقرأ منخفضة الجودة وتصحيح الأخطاء وإخفاء UID استخدام نكفيلتير- 
	NCfilter(own) نكفيلتير تصفية-l 5-q 0.5-n 0.1-تي fastq1 3-G-1 fastq2-2 realSeq(own) بيثون بن/ريلريلسيق fq1 ماسكويد-1 fq2-2-o الإخراج dir-p بادئة-ش 4-s 7-م 3-i أويدفيلي-ف.</li>
	<li>المراجع hg19 المجين (الجينوم البشري 19)، حدد موقع النتائج التسلسل باستخدام mem التحالف (الإصدار 0.7.12-r1039) ومواءمة مع أدوات تحليل الجينوم (جتك) (الإصدار 3.4-46-gbc02625)- 
	التحالف mem-t 3 hg19 fastq1 fastq2 جافا-d64-خادم--XX: + أوسيباراليلجك--XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g- Djava.io.tmpdir=/tmp/-جرة GenomeAnalysisTK.jar-T تارجيتريجيون-L hg19 ريليجنيرتارجيتكريتور-R-المعروف dbsnp &#8212; 
	اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-nt 10-أنا كانسيربام-أنا نورمالبام جافا-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 إينديلريليجنير-R جرة GenomeAnalysisTK.jar-T-المعروف dbsnp -اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس &#8212; فترات تارجيتينتيرفالس--أنا كانسيربام--أنا نورمالبام</li>
	<li>المجموعة المكررة حسب المعرف الفريد وموقف أجزاء القالب، التي سيتم تصحيح الخطأ عرضته بكر/تسلسل القواعد وتعديل نوعية قاعدة. 
	realSeq(own) الكتلة بيثون ريلسيق/بن/ريلسيق-ب-ص unmarkdup_sort_merge.bam تشيبريجيون-س output_dir-ف بادئة-م 6</li> <li>إعادة محاذاة التكرارات متفاوت المسافات من التحالف mem. 
	التحالف mem-t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>القيام بإعادة تنظيم محلي متبوعاً تقويم نقاط الجودة الأساسية باستخدام جاتك (الإصدار 3.4-46-gbc02625)- 
	التقويم Loacal: جافا-d64-خادم--XX: + أوسيباراليلجك--XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-جرة GenomeAnalysisTK.jar-T ريليجنيرتارجيتكريتور-R hg19-L تارجيتريجيون-المعروف dbsnp-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-nt 10 --كانسيربام-أنا نورمالبام جافا-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 جرة GenomeAnalysisTK.jar-T إينديلريليجنير-R-المعروف dbsnp-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-تارجيتينتيرفالس فترات-أنا كانسيربام--أنا نورمالبام قاعدة نقاط الجودة تقويم: جافا-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-تارجيتريجيون-L hg19 باسيريكاليبراتور-R جرة GenomeAnalysisTK.jar-T- كنوونسيتيس dbsnp-كنوونسيتيس الكونية-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-nct 10-أنا جافا الفايبرجلاس-س أم-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-جرة GenomeAnalysisTK.jar-T برينتريدس--أنا أم-بقسر الفايبرجلاس-س أووتبام hg19-R-nct 8-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس</li> <li>الهولندية (متغير واحد-النوكليوتيدات) والدعوة إينديل (الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف)، دقة الطفرات ذات التردد المنخفض أكد GSR (الدعم الجيد ما يلي) مع كل قراءة حبلا إلى الأمام وعكس أزواج والترشيح من خلال مجموعة المراقبة (germline الطفرات) وقاعدة بيانات خط الأساس- 
	realDcaller(own) بيثون ريلدكالير-و hg19-r تشيبريجيون-ج باسيلينيدب-O-L كانسيربام 2 نورمالبام-ف 30</li> <li>استخدام عينات أساسية كعنصر تحكم للاتصال المسيحي (تباين عدد نسخ)- 
	NCcnv(own) بيثون نككنف-س كنفدير-t tmpdir-r تشيبريجيون المسيحي-نورمجت نورمالبام-تومجت كانسيربام-ريبدب ريبيتمارسك</li> <li>ريليجنيد غير معينة، مقاطع ويقرأ زوج المتنافرة لاستدعاء SV (تباين). 
	NCsv(own) بيثون نكسف tmpdir-تي-آر hg19-س أووتبوتدير بواباث نسخة-س-ث-ن 4 نورمالبام كانسيربام</li></ol>

<ol><li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+genotyping+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li>
<li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li>
<li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li>
<li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences%3A+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Catherine_Alix-Panabieres/publication/51770394_Circulating_Tumor_Cells_and_Circulating_Tumor_DNA/links/00b4953b6621e29429000000.pdf">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li>
<li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li>
<li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li>
<li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

واكتشفت وجود تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) أكثر من 30 عاماً، لكن لا يزال غير روتينية في الممارسة السريرية من تطبيق تحليلات كتدنا. تزايد الاهتمام في التطبيق العملي لأساليب كتدنا مع تطوير تكنولوجيات للكشف عن كتدنا والتحليل. رصد الورم مع كتدنا يقدم نهجاً كسبها لتقييم الداء المتبقي مجهرية، استجابة للعلاج، وملامح الجزيئية الورم تحت خلفية الورم تطور و intratumoral التغايرية13، 14. وسيسهل التحسينات في الحساسية والنوعية لتحليل جميع هذه التطبيقات15</...

الجيل التالي التسلسل (خ ع)، أداة قوية للتحقيق أسرار الجينوم، يمكن أن توفر كمية كبيرة من المعلومات التي قد تكشف عن التعديلات الوراثية. تطبيق تحليل خ ع في العيادة قد أصبحت أكثر شيوعاً، خاصة بالنسبة للطب شخصية. واحدة من أكبر القيود المفروضة على خ ع، غير أن نسبة خطأ عالية. على الرغم من أنها تعتبر مناسبة لدراسة الطفرات الموروثة، هو تحليل الطفرات نادرة إلى حد كبير محدودة1،2، خاصة عند تحليل الحمض النووي التي تم الحصول عليها من "خزعة سائلة".
تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) هو دون خلايا الحمض النووي (كفدنا) في الدم الذي هو يسفك من الخلايا السرطانية. وفي معظم الحالات، كمية كتدنا منخفضة للغاية، الذي جعل الكشف والتحليل صعبة للغاية. ومع ذلك، قد كتدنا العديد من السمات الجذابة: عزلتها كسبها، ويمكن الكشف عن ذلك في المراحل المبكرة من نمو الأورام، ويعكس مستوى كتدنا الكفاءة العلاجية وكتدنا يحتوي على طفرات الحمض النووي الموجودة في الآفات الأولية والمنتشر 3 , 4 , 5-ولذلك، ونظرا للتطور السريع لهذه التقنية خ ع والتحليل، التطبيق للكشف عن كتدنا أصبح أكثر جاذبية.
استخدمت نهوج مختلفة يسلسل موازية على نطاق واسع للكشف عن كتدنا ولكن أيا من هذين النهجين قد قبلت للاستخدام الروتيني في العيادات بسبب محدوديتها: انخفاض حساسية والافتقار إلى التنوع، وتكلفة عالية نسبيا6 ،،من78. على سبيل المثال، تسلسل المزدوجة، استناداً إلى علامة معرف فريد (UID)، مرارا وتكرارا بتصحيح الأخطاء في bidirectionally إلى توافق في الآراء، تصحيح معظم الأخطاء الخاصة بالتسلسل. ومع ذلك، يضيع جدوى هذا الأسلوب نظراً للتكلفة العالية وانخفاض بيانات الاستخدام9،10. وبالمثل، Seq كاب وبه تكرار محسنة، كاب-ايديس11،12، يكون التطبيق العملي أكبر في الكشف عن كفدنا، على الرغم من دقة وشمولية هذه الطرق بحاجة إلى التحسين.
لتلبية الاحتياجات الحالية للكشف عن كتدنا دقيقة وتحليل، قمنا بتطوير استراتيجية جديدة، "إثراء نادرة الطفرات التسلسل" (ER-Seq). يجمع هذا النهج بين ما يلي: محولات تسلسل فريدة من نوعها لاستعادة كفاءة الجزيئات كتدنا، مع تصحيح الخطأ ثنائي الاتجاه، والقدرة على التمييز بين طفرة واحدة من أصل &#62; 1 × 107 نوع البرية النيوكليوتيدات؛ المسابر 1021 كيلو بايت التي تثري قياس مناطق المستهدفة التي تغطي أكثر من 95% الطفرات المتصلة بورم من الأورام 12، بما في ذلك سرطان الرئة، سرطان القولون والمستقيم، سرطان المعدة، وسرطان الثدي، وسرطان الكلي، سرطان البنكرياس، سرطان الكبد، سرطان الغدة الدرقية، سرطان عنق الرحم، وسرطان المريء، وسرطان بطانة الرحم (الجدول 1)؛ وفحص قاعدة بيانات خط الأساس جعلها فعالة وسهلة لدقة الكشف عن الطفرات النادرة في كتدنا.
لإنشاء قاعدة بيانات خط أساس، تجد جميع طفرات الجينات واسطة ER-Seq من عدد من نفس النوع من العينات (~ 1000 في البداية). يجب التحقق من هذه الطفرات الحقيقية بالعديد من أساليب الكشف موثوقة والتحليل. بعد ذلك، تلخيص نمط الطفرات كاذبة والمجموعة جميع الطفرات كاذبة لبناء قاعدة بيانات خط الأساس الأولى. استمر في إضافة الطفرات كاذبة تبين من التجارب اللاحقة التسلسل إلى قاعدة البيانات هذه. ولذلك، يصبح هذا قاعدة بيانات خط الأساس توسيع قاعدة بيانات ديناميكية، مما يحسن إلى حد كبير من دقة تسلسل.
لتعزيز التقدم المحرز في تشخيص الورم، والرصد، ونقدم ER-Seq، وسيلة منخفضة التكلفة ومجدية للحصول على بيانات عالمية. نقدم دراسة الحالة التي خضعت للتحليل ER Seq، مما يدل على دقة للكشف عن الطفرات النادرة وجدوى استخدامها في العيادة.

<table><tbody><tr><td>QIAamp مجموعة الحمض النووي المنتميم</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>استخراج الحمض النووي من الدم المحيطي ل cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>استخراج الحمض النووي من الدم المحيطي ل gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>قياس تركيز cfDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td> تركيز المكتبة</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 الكواشف</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>قياس cfDNA وشظايا المكتبة</td></tr><tr><td>مجموعة إعداد مكتبة NEBNext UltraII لإعداد مكتبة Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect الكاشف</td><td>Beckman</td><td>B23317</td> فحص <td>وتنقية شظايا الحمض النووي</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.0) -100 مل</td><td>سيجما</td><td>93283</td><td>انحلال</td></tr><tr><td>مجسات xGen Lockdown</td><td>IDT</td> <td>& [مدش] ؛ و [مدش]</td><td>مسبار مخصص xGen</td></tr><tr><td>حياة الحمض النووي البشري Cot-1</td><td></td><td>15279-011</td> التقاط <td>الحمض النووي المستهدف</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>التقاط الحمض النووي</td></tr><tr><td>المستهدف xGen Lockdown كواشف</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>التقاط الحمض النووي المستهدف</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>مكتبات إثراء PCR بعد الالتقاط</td></tr><tr><td>KAPA مجموعة القياس الكمي لمكتبة</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>قياس تركيز المكتبة</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2 ((150 دورة)</td> <td>illumina</td><td>FC-404-2002</td> جهاز طرد <td>مركزي متسلسل5810</td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>قياس تركيز gDNA</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>حضانة</td></tr><tr><td>16 أنبوبا DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>مكثف بالإضافة إلى</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الكشف عن الطفرات النادرة في كتدنا باستخدام تسلسل الجيل القادم

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

تحليل تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) باستخدام الجيل التالي التسلسل (خ ع) أصبح أداة قيمة لتطوير علم الأورام السريري. ومع ذلك، تطبيق هذا الأسلوب تحديا بسبب حساسيتها منخفضة في تحليل تتبع كمية من كتدنا في الدم. وعلاوة على ذلك، قد تنشئ الطريقة النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة من هذا التحليل تتابعها واللاحقة. تحسين جدوى وموثوقية للكشف عن كتدنا في العيادة، هنا نقدم أسلوب الذي يثري الطفرات النادرة للتسلسل، "التسلسل طفرة نادرة إثراء" (ER-Seq). يمكن تمييز ER-Seq طفرة واحدة من أصل 1 × 107 نوع البرية النيوكليوتيدات، مما يجعله أداة واعدة للكشف عن التعديلات الوراثية الغاية منخفضة التردد، وهكذا سوف تكون مفيدة جداً في دراسة هيتيروجينيسيتي المرض. حكم ربط المحول تسلسل فريد من نوعه، يتيح هذا الأسلوب استعادة كفاءة الجزيئات كتدنا، بينما في الوقت نفس تصحيح للأخطاء bidirectionally (معنى و antisense). لدينا مجموعة المجسات 1021 كيلو بايت يثري قياس المناطق المستهدفة التي تغطي أكثر من 95% الطفرات سائق ذات الصلة بورم في الأورام 12. تتيح هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة والعالمي إلى تراكم نجاح فريد من البيانات الوراثية. بعد كفاءة تصفية الأخطاء في الخلفية، ER-seq دقة الكشف عن الطفرات النادرة. استخدام دراسة الحالة، نقدم بروتوكول مفصلة تثبت المسبار تصميم وبناء مكتبة، ومنهجيات التقاط الحمض النووي المستهدف، بينما أيضا بما في ذلك سير العمل تحليل البيانات. عملية الاضطلاع بهذه الطريقة عادة ما يأخذ 1-2 أيام.

المسابر 1021 كيلو بايت المناطق المستهدفة المخصب يستخدم في ER-Seq ترد في الجدول 1، التي تغطي أكثر من 95% طفرات الجينات في 12 من الأورام الشائعة. مجموعة واسعة من هذه المسابر يجعل هذه العملية تنطبق على غالبية مرضى السرطان. بالإضافة إلى ذلك، لدينا محولات تسلسل فريدة من نوعها وفحص قاعدة بيانات خط الأساس جعلها ممكنة للكشف عن الطفرات النادرة تحديداً.
نظراً للخصائص المختلفة لجدنا وكفدنا المستخرجة من ال...

ويصف هذه المخطوطة تقنية للكشف عن الطفرات من ذات التردد المنخفض في كتدنا، يليها ER ويتمايز هذا الأسلوب باستخدام فريدة من نوعها تصحيح الخطأ اثنين ثنائي الاتجاه، وتصفية الخلفية الخاصة، واكتساب كفاءة الجزيئية.

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

الهدف العام من هذه التقنية هو اكتشاف الطفرات ذات التردد المنخفض في الورم المنتشر أو ctDNA لتزويد الأطباء السريريين بأداة قوية لتشخيص الأورام ومراقبة ديناميكيات الورم استجابة للعلاج. يمكن أن تساعد طريقة اختبار ctDNA في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول أنواع الطفرات التي يحملها المريض مثل التباين من النوع النووي الفردي ، وحذف الإدراج ، واختلاف رقم النسخ ، والتباين الهيكلي. الميزة الرئيسية لهذا التقني هي الحساسية العالية والخصوصية التي تكشف بدقة عن الطفرات منخفضة التردد في ctDNA.سيوضح الإجراءات يوليانغ يانغ ، فني من مختبري. للبدء ، اسحب 10 مل من الدم المحيطي في أنبوب تجميع واقلب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل ست إلى ثماني مرات لخلط المحتويات. قم بتخزين عينات الدم في أنابيب التجميع عند درجة حرارة تتراوح من ست إلى 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.جهاز الطرد المركزي أنبوب التجميع عند 1 ، 600 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم استخدم ماصة التخلص لنقل المادة الطافية أو البلازما من الأنبوب إلى أربعة أنابيب طرد مركزي نظيفة سعة ملليلترين تحمل علامة مناسبة دون إزعاج الحبيبات. استخدم ماصة التخلص النظيفة لنقل مليلتر واحد من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مسمى ملليلترين بشكل مناسب.قم بتخزين الخلايا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو أكثر برودة قبل عزل الجينوم أو الحمض النووي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للبلازما عند 1،600 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم انقل البلازما لتنظيف أنابيب الطرد المركزي المسماة بشكل صحيح على أنها بلازما ، مع ترك ما يقرب من 0.1 ملليلتر من الحجم المتبقي في الأسفل لتجنب التلوث.يجب تجنب الطبقة المصفرة من البلازما أثناء عملية الفصل. خلاف ذلك ، قد تؤدي شظايا الحمض النووي الكبيرة المستخرجة من الخلايا إلى تخفيف ctDNA وتؤثر على حساسية الاختبار. باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا ، قم بعزل cfDNA من ثلاثة ملليلتر من البلازما المجمعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.ثم أيضا باستخدام مجموعة ، قم بعزل gDNA من 200 ميكرولتر من خلايا الدم البيضاء باتباع تعليمات الشركة المصنعة. لتجزئة عينة التحكم في gDNA عن طريق الصوتنة ، قم بإعداد ميكروغرام واحد من عينة gDNA في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA في أنبوب صوتنة نظيف. اضبط برنامج الصوتنة على 30 ثانية وإيقاف التشغيل لمدة 30 ثانية لمدة 12 دورة لما مجموعه 12 دقيقة.بعد التأكد من أن المنتج يحتوي على 200 إلى 250 قطعة زوج أساسي ، انقل جميع منتجات التجزئة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 150 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي واحتضان العينة لمدة خمس دقائق لتحديد الأجزاء الصحيحة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 30 ثانية وقم بإزالة المادة الطافية. ثم مع الاحتفاظ بالأنبوب على الرف ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ لغسل الخرز.احتضن الخرزات لمدة 30 ثانية قبل إزالة المادة الطافية وكرر الغسيل. احتفظ بالأنبوب على الرف مع فتح الغطاء لتجفيف الخرز في الهواء. ثم قم بمسح شظايا الحمض النووي بإضافة 32 ميكرولتر من 10 ملليمولار Tris-HCL إلى الخرز.لتنفيذ تفاعل الإعداد النهائي باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، إلى أنبوب معقم خال من النوكلياز ، أضف سبعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتفاعل ، وثلاثة ميكرولترات من مزيج الإنزيم ، و 30 نانوغراما من cfDNA ، والماء المقطر بشكل مضاعف لحجم إجمالي يبلغ 60 ميكرولترا. في أنبوب منفصل ، أضف نفس المكونات ولكن باستخدام ميكروغرام واحد من gDNA بدلا من cfDNA. يحتضن الخليط في دورة حرارية على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة متبوعا ب 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة دون تسخين الغطاء.مباشرة بعد الحضانة ، أضف 30 ميكرولترا من مزيج الربط الرئيسي ، وميكرولتر واحد من محسن الربط ، وأربعة ميكرولترات من محول التسلسل الفريد إلى الأنبوب. احتضان التفاعل في التدوير الحراري عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة دون تسخين الغطاء. دوامة لإعادة تعليق الخرز المغناطيسي وترك الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.ثم أضف 87 ميكرولترا من الخرزات المغناطيسية المعلقة إلى تفاعل الربط. تخلط جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ثم احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد غسل الخرزات وتجفيفها بالهواء ، قم بإزالة هدف الحمض النووي من الخرزات بإضافة 20 ميكرولتر من 10 ملليمولار Tris-HCL.أضف 20 ميكرولترا من شظايا الحمض النووي المربوطة بالمحول ، وخمسة ميكرولترات من برايمر الفهرس i7 ، و 25 ميكرولترا من المزيج الرئيسي لتضخيم المكتبة ، والماء المقطر بشكل مضاعف يصل حجمه الإجمالي إلى 50 ميكرولترا. PCR تضخيم المحول المرتبط ب cfDNA أو gDNA. ثم أضف 45 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المعلق إلى الحمض النووي المخصب ب PCR.امزج العينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل واحتضانها لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية وغسل الخرزات ، استخدم 30 ميكرولترا من 10 مللي مولار Tris-HCL لمسح شظايا الحمض النووي بالمحولات. لإجراء التقاط الحمض النووي المستهدف ، في أنبوب معقم ، قم بحظر العينة عن طريق إضافة 1.5 ميكروغرام من مكتبات التجميع ، وثمانية ميكرولترات لكل من كتلة P5 100P و P7 كتلة 100P ، وخمسة ميكرولترات من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من الحمض النووي الواحد.جفف محتويات الأنبوب باستخدام مكثف فراغ ضبط على 60 درجة مئوية. قم بتهجين مجسات التقاط الحمض النووي مع المكتبة عن طريق إضافة 8.5 ميكرولتر من مخزن التهجين 2X ، و 2.7 ميكرولتر من محسن التهجين ، و 1.8 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج الخالي من النوكلياز. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل واحتضانه في الخلاط الحراري على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.ثم أضف على الفور أربعة ميكرولترات من المسبار المخصص. احتضان العينات في خلاط حراري عند 65 درجة مئوية مع تسخين الغطاء إلى 75 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. احتضان الحمض النووي المستهدف المهجن بخرز الستربتافيدين ثم اغسل الخرزات لإزالة الحمض النووي غير المرتبط.استخدم المجموعة التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للحصول على 20 ميكرولترا نهائيا من الخرز المعلق مع شظايا الحمض النووي الملتقطة. يجب أن تكون خطوة غسل الحمض النووي غير المرتبط من حبات الستربتافيدين سريعة. خلاف ذلك ، قد تتأثر كفاءة التقاط الحمض النووي المستهدف.قم بتضخيم شظايا الحمض النووي الملتقطة عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تجارية تحتوي على اثنين من قليل النوكليوتيدات الأساسية الدقيقة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أخيرا ، أضف 45 ميكرولترا من الخرز المعلق مباشرة إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل وإثراء شظايا الحمض النووي المستهدف المضخم المرتبطة بالخرز عن طريق الشطف ب 30 ميكرولتر من 10 مللي مولار Tris-HCL. تحديد الأجزاء وإجراء التسلسل وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.يوضح هذا الجدول كيف يحسن ER-seq عمق التغطية بنسبة 23٪ مقارنة بالطريقة التقليدية. ويرجع ذلك إلى استعادته الفعالة لجزيئات cfDNA ، مما يعزز بشكل كبير تحليل الطفرات النادرة. من الواضح أيضا أن محولات التسلسل الفريدة المستخدمة في ER-seq تتيح سهولة التمييز بين الازدواجية الطبيعية والناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).كما هو مفصل في هذا الجدول حول نتائج الاستدعاء ، كان التحليل المستند إلى ER-seq متسقا بنسبة 100٪ لاكتشاف EGFR pL858R وكان تكرار الكشف أعلى قليلا عند مقارنته بالتحليل التقليدي. الأهم من ذلك ، أن تحليل ER-seq مكن من اكتشاف طفرات أخرى منخفضة التردد نسبيا بما في ذلك EGFR pT790M التي لم يتم التعرف عليها من خلال التحليل التقليدي بسبب ضوضاء الخلفية العالية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 48 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب فقدان كمية منخفضة جدا من cfDNA أثناء الاستخراج وإعداد المكتبة وغسل الخرز بعد التهجين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع ctDNA من المريض وإعداده واستهدافه بناء على التحديد الفريد للتسلسل. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخزعة السائلة لاستكشاف ممارسات أفضل في اتخاذ قرارات العيادة.

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

وصفنا إعداد مكتبات الحمض النووي barcoded واللاحقة المستندة إلى التهجين التقاط اكسون للكشف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان الرئيسية في عينات الورم السريرية التي المتوازية "الجيل القادم" التسلسل. استهداف تسلسل اكسون يقدم فوائد إنتاجية عالية وتكلفة منخفضة، وتغطية تسلسل عميق، وبالتالي العائد حساسية عالية للكشف عن الطفرات التردد المنخفض.

الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

تصف هذه المخطوطة البروتوكولات السريرية لوحتين من التسلسل من الجيل التالي. تستجوب إحدى اللوحات الأورام الخبيثة الدموية بينما تستهدف اللوحة الأخرى الجينات التي تتحور عادة في الأورام الصلبة. يوفر التصنيف الجزيئي لطفرات الدافعة في الأورام الخبيثة البشرية معلومات تنبؤية وتنبؤية قيمة.

الجيل القادم التسلسل للكشف عن المنحى الطفرات في الأورام الصلبة والسائلة

تم وصف نظام متكامل لتسلسل الجيل التالي المستهدف لعينات الأورام. تم تحسين هذا النظام عبر الأنظمة الأساسية لخزعات الورم منخفضة الجودة ومنخفضة الكمية ، ويستوعب مدخلات الحمض النووي المنخفضة ، ويتضمن ضوابط متعددة المتغيرات جيدة الخصائص ، ويتميز بمتصل متغير جديد يتم إبلاغه بتدابير مراقبة الجودة الكمية قبل التحليل.

التكامل بين الرطب والعمليات مقعد الجافة يحسن المستهدفة تسلسل الجيل التالي من ذات جودة منخفضة ومنخفضة كمية التحليلات ورم

يوفر تفاعل البوليميراز المتسلسل المحظور من النوع البري متبوعا بالتسلسل المباشر طريقة حساسة للغاية للكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد في مجموعة متنوعة من أنواع العينات.

من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

ويصف المخطوط القائم على رقاقة رقمية PCR مقايسة للكشف عن CDH1 نادرة نسخة variant (CDH1a) في العادي مجمدة طازجة وورم الأنسجة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة.

الكشف عن متغير CDH1 نسخة نادرة في الأنسجة المجمدة الطازجة سرطان المعدة ببكر الرقمية المستندة إلى شرائح

الجيل التالي التسلسل (خ ع) هو أداة قوية لتوصيف الجينوم محدود بنسبة الخطأ عالية من النظام الأساسي (~0.5–2.0%). يصف لنا أساليب عملنا لتصحيح خطأ في تسلسل التي تسمح لنا بتفادي نسبة الخطأ خ ع والكشف عن الطفرات في اليل البديل الكسور نادرة ك 0.0001.

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

نقدم هنا، بروتوكولا لدقة تحديد مقدار التعديلات الوراثية متعددة من المنطقة المستهدفة في رد فعل واحد استخدام دبكر الإنزال وزوج فريدة من المسابر التحلل المائي.

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن الطفرات الجسدية الورم في تعميم الحمض النووي الموجود في السوائل البيولوجية المريض (السوائل الحيوية). لدينا قطرات الرقمية البوليميراز سلسلة رد الفعل (dPCR) طريقة تستند إلى تمكين القياس الكمي لطفرة الورم تردد الاليليك (MAF)، مما يسهل تكملة طفيفة التوغل لتشخيص والرصد الزمني للاستجابة الورم.

الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

يظهر هنا إندونوكلياز sgRNA/CAS9 وبروتوكول تسلسل الجيل التالي الذي يمكن استخدامه لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج بالقرب من مروج CD4.

استخدام تسلسل الجيل التالي لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج الناجم عن CAS9 بالقرب من مروج CD4

يصف هذا البروتوكول سير عمل تسلسل الجيل التالي الآلي والمعتمد من ISO15189 للكشف عن التغيرات الجينومية القابلة للاستهداف في الأنسجة المضمنة بالبارافين الثابت بالفورمالين لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC).

الكشف عن التغيرات القابلة للاستهداف في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة باستخدام تسلسل الجيل التالي

اكتشف تقنية ER-Seq للكشف عن الطفرات النادرة في ctDNA باستخدام تصحيح الخطأ ثنائي الاتجاه. توفر هذه الطريقة حساسية وخصوصية عالية لتشخيص الأورام ومراقبة الاستجابة العلاجية بدقة.

الكشف عن الطفرات النادرة في كتدنا باستخدام تسلسل الجيل القادم

استكشف المزيد من الفيديوهات