البلعمة فحص الخلايا الخلوية في ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس البلعمة في الجسم الحي ذبابة الفاكهة لتقييم تورط جينات معينة ذات أهمية في ابتلاع الخلايا المبرمجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم المناعة وعلم الأحياء التنموي حول الآليات التي ينطوي عليها ابتلاع الخلايا المبرمجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدام الخلايا بسهولة وبدقة قياسها في مستويات البلعمة في الجسم الحي.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج الاضطرابات الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية حيث أن الخلايا المبرمج عن طريق البلعمة ضرورية لإزالة الخلايا الخطرة التي تسبب الالتهاب. ابدأ بإضافة 200 ذبابة فاكهة بالغة و 200 ذبابة فاكهة بالغة وطبق من أجار عصير العنب الطازج على الخميرة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أغلق الأنبوب بغطاء إسفنجي واحتضن الذباب في الضوء عند 16 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

في نهاية الحضانة ، انقل الذباب إلى 25 درجة مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة واستبدل اللوحة القديمة بلوحة جديدة بدون خميرة. اسمح للذباب بوضع البيض لمدة ساعتين. ثم احتضان اللوحة على حرارة 16 درجة مئوية لمدة 26 ساعة.

في اليوم التالي ، استخدم فرشاة طلاء لنقل الأجنة إلى مليلتر واحد من PBS مكملا بنسبة 0.2٪ Triton X-100. بعد غسلتين ، أضف 1.2 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم إلى الأجنة لإزالة المشيمة. بعد ثلاث دقائق ، اغسل الأجنة أربع مرات في PBS الطازج بالإضافة إلى Triton X-100.

انقل الأجنة المغسولة إلى صفيحة الاغاروز التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات وضع اللوحة تحت مجهر تشريح. حدد أجنة المرحلة 16 باستخدام طرف صغير. استخدم ماصة دقيقة لنقل ما يقرب من 50 من أجنة المرحلة 16 إلى أنبوب اختبار دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

لعزل الخلايا الجنينية ، اغسل الأجنة أولا مرتين باستخدام 150 ميكرولتر من PBS. انقل الأجنة إلى أنبوب اختبار دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 200 ميكرولتر من الكولاجيناز وقم بتجانس الأجنة 30 مرة باستخدام خلاط الحبيبات.

في نهاية التجانس ، قم بتقطيع الخلايا الجنينية 10 مرات ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بترتيورث الخلايا 10 مرات أخرى وأعدها إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة أخرى.

في نهاية الحضانة الثانية ، أضف 800 ميكرولتر من PBS إلى الخلايا واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من التربسين قبل تصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون. أوقف النشاط الأنزيمي باستخدام 40 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة في 800 ميكرولتر من PBS وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الخلايا المترسبة في 200 ميكرولتر من PBS الطازج واجمع الخلايا باستخدام طرد مركزي آخر. أعد تعليق الحبيبات في 30 ميكرولتر من PBS وقم بتركيب الخلايا على شريحة زجاجية مطلية بأمينوبروبيل ثلاثي الإيثوكسيسيلان. عندما يتم توصيل الخلايا ، استخدم ماصة لإزالة PBS الزائد من الشريحة وإصلاح الخلايا ب 60 إلى 70 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد.

بعد 10 إلى 15 دقيقة ، قم بإزالة المثبت وغسل الخلايا في PBS لمدة دقيقة واحدة. لتلطيخ الخلايا بجسم مضاد مضاد للكرومورت ، انقع الشريحة أولا بشكل متسلسل في الميثانول ثم PBS مكملا بنسبة 0.2٪ Triton X-100 متبوعا ب PBS وحده. بعد ذلك ، قم بحظر الارتباط غير المحدد ب 20 ميكرولتر من مصل الخنازير الكامل بنسبة 5٪ في PBS بالإضافة إلى 0.2٪ Triton X-100 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة محلول الحجب الزائد وقم بتسمية الخلايا ب 20 ميكرولترا من مصل مضاد الكرومورت عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اغسل الشريحة في PBS plus Triton X-100 لمدة خمس حضانات لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل الأخير ، اشطف الشريحة في PBS لمدة 10 دقائق.

ثم قم بتسمية الخلايا ب 20 ميكرولترا من IgG المضاد للفوسفاتيز القلوي المسمى بالفوسفاتيز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، اغسل الشريحة خمس مرات في PBS بالإضافة إلى Triton X-100 كما هو موضح متبوعا بنقع لمدة 10 دقائق في محلول عازل. ثم قم بتسمية الخلايا بمحلول ركيزة الفوسفاتيز وراقب الخلايا تحت المجهر الضوئي.

عندما تظهر إشارات أرجوانية قوية في حبيبات الخلايا الدموية ، قم بإزالة الركيزة الزائدة وانقع الشريحة في مخزن مؤقت مكمل ب EDTA لمدة خمس إلى 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، اشطف الخلايا بغسلتين من PBS لمدة خمس دقائق وعالجها بمخزن مؤقت للتوازن لمدة 10 دقائق. بعد إزالة المحلول ، قم بتسمية الخلايا ب 20 ميكرولتر من محلول ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

ثم قم بإزالة المحلول من الشريحة وانقع الخلايا في 0.5 مل توقف عن الغسيل في 17 مل من الماء لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اشطف الخلايا بثلاث غسلات PBS لمدة خمس دقائق وقم بتسميتها ب 20 ميكرولترا من بيروكسيداز الديجوكسيجينين المضاد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا أربع مرات في PBS كما هو موضح وانقع الشريحة في ركيزة البيروكسيديز بزيادات قدرها 30 ثانية حتى تتحول الخلايا المبرمج إلى اللون البني.

عندما يتم تحقيق التلوين الأمثل ، انقع الشريحة في الماء لإيقاف تفاعل البيروكسيداز. في هذه الصور ، ذبابة الفاكهة ، تم تلطيخ البلاعم التي تسمى الخلايا الدموية لعلامة الخلايا الدموية Croquemort ولوجود خلايا موت الخلايا المبرمجة بواسطة TUNEL في الخلايا الجنينية المتناثرة كما هو موضح للتو. تظهر الخلايا الإيجابية كرومورت إشارات أرجوانية في حبيبات خلاياها الصغيرة بينما أظهرت الخلايا الإيجابية TUNEL إشارة بنية في جثمها بأكملها.

بدلا من ذلك ، يمكن تلطيخ الخلايا الدموية بجسم مضاد مضاد ل GFP يلطخ الخلايا الدموية بأكملها بدلا من الحبيبات فقط. في هذه التجربة ، تم تحليل نسبة الخلايا الدموية البلعمية إلى إجمالي الخلايا الدموية في النوع البري أو الأجنة الطافرة المفردة ، مما يدل على أن مؤشر البلعمة كان أقل في كلتا السلالتين الطافرة المفردة منه في الذباب من النوع البري بينما كانت الأعداد الإجمالية للخلايا الدموية والخلايا المبرمجة متشابهة مما يشير إلى متطلبات الجينات المتحولة لابتلاع الخلايا المبرمجة. يقلل الضربة القاضية RNAi للجينات المفردة أيضا من مؤشر البلعمة بينما ظلت الأعداد الإجمالية للخلايا الدموية والخلايا المبرمجة قابلة للمقارنة ، مما يؤكد بشكل أكبر على تورط مستقبلات البلعمة التي تم فحصها في البلعمة بوساطة الخلايا المبرمجة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي 15 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب علامات الخلايا الدموية الزائدة وتلطيخ TUNEL للتقييم الأمثل لقدرة الخلايا البلعمة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحص البلعمة في الموقع لجميع أجنة ذبابة الفاكهة للإجابة على أسئلة إضافية حول موقع الابتلاع أو توزيع الخلايا الدموية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف آليات ابتلاع الخلايا المبرمجة في ذبابة الفاكهة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس البلعمة في الجسم الحي في ذبابة الفاكهة الأجنة.