تشريح وإعداد شريحة الاكليلية وضع الغدة النخامية الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق أقسام الغدة النخامية التاجية المناسبة مع بنى الأنسجة المحفوظة جيدا من الفئران النامية. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطور الغدة النخامية ، مثل أنسجة الغدة النخامية ، وتمايز الخلايا ، والتكاثر ، وموت الخلايا المبرمج. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تشريح الغدة النخامية النامية للفئران دون تلف مرئي وتوجيهها بشكل صحيح لتحقيق الأقسام الإكليلية.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا أنه من الصعب تقنيا الحصول على أقسام إكليلية مناسبة لتطوير الغدة النخامية في الفئران. بعد تخدير الفئران وإصلاحها وفقا لبروتوكول النص ، استخدم المقص لقطع عظم الجمجمة. بعد ذلك ، باستخدام ملقط ، ارفع الدماغ الخلفي برفق من قاعدة الجمجمة.

بعد ذلك ، عند أول علامة على sella turcica ، توقف عن الرفع ولكن أمسك الدماغ الخلفي ، واستخدم مقصا دقيقا لقطع ساق الغدة النخامية والألياف العصبية المتصلة بقاعدة الدماغ. الاستمرار في رفع وإزالة الدماغ كله لكشف الغدة النخامية بالكامل. تقع الغدة النخامية على السطح الظهري للعظم الوتدي وتحيط بها بشكل جانبي أعصاب ثلاثية التوائم.

ثم استخدم المقص لقطع منطقة التوائم بأكملها بما في ذلك الغدة النخامية والأعصاب ثلاثية التوائم الجانبية وتحت العظم الوتدي. ضع المنديل في طبق 35 مم يحتوي على 4٪ PFA ، واحتضنه عند 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة إلى 3 ساعات ، حسب الأعمار. ثم استخدم 10 مل من PBS لغسل الأنسجة الثابتة لخمسة تغييرات في 15 دقيقة لكل منها.

انقل الأنسجة الثابتة إلى طبق 35 مم يحتوي على 1 مل من PBS ، وتحت المجهر المجسم ، قم بفصل الغدد النخامية. بالنسبة لغدة النخامية P5 إلى P14 ، باستخدام ملقط ومقص رفيع ، قم بإزالة الأغشية الضامة بين الأعصاب والعظام ، وعزل الغدة النخامية بعناية مع الأعصاب ثلاثية التوائم الجانبية ككل ، مع ترك sella turcica. بالنسبة ل P21 وغدة النخامية البالغة ، قم بإزالة الأعصاب والأغشية الضامة حول الغدة النخامية ، وحرر الغدة من الأنسجة المحيطة.

بعد الجفاف ، وإزالة الزيلين ، وتسلل الشمع وفقا لبروتوكول النص ، على نظام وحدة التحكم في تضمين الأنسجة ، قم بإزالة العينة من الكاسيت وضعها في قالب أساسي نصف مملوء بشمع البارافين المنصهر. بالنسبة للغدد النخامية P21 والبالغين ، استخدم ملقطا دقيقا دافئا لوضع الغدة النخامية بمحورها القصير العمودي على السطح السفلي للقالب الأساسي. بالنسبة للغدة النخامية P0 إلى P4 ، قم بتوجيه العينات بعظامها الوتدية بشكل عمودي على السطح السفلي للقالب الأساسي.

بالنسبة للغدد النخامية P5 إلى P14 ، قم بتوجيه العينات بأعصابها ثلاثية التوائم بشكل عمودي على السطح السفلي للقالب الأساسي. بعد وضع الغدة ، استخدم ملقطا دقيقا دافئا لتثبيت الأنسجة برفق في الموضع المطلوب حتى يصبح الشمع شبه صلب على لوح التبريد. قم بتعبئة القالب بشمع البارافين المنصهر.

اترك كتلة البارافين لتبرد حتى يتجمد الشمع تماما. قم بتبريد كتلة البارافين عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 إلى 20 دقيقة ، ثم استخدم ميكروتوم لتقطيعها إلى شرائح رفيعة ، وضبط موضع كتلة البارافين أثناء التقسيم. قم بإجراء الملصقات المناعية وفقا لبروتوكول النص.

كما هو موضح هنا ، لتشريح الغدة النخامية من الفأر حديثي الولادة ، تم تشريح المنطقة الفيلار بأكملها التي تحتوي على الغدة النخامية والأعصاب ثلاثية التوائم والعظم الوتدي تحتها من قاعدة الجمجمة. ظلت الغدة النخامية الصغيرة والحساسة سليمة أثناء العملية. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن خمسة أيام ، تم عزل الغدد النخامية المرتبطة بالأعصاب ثلاثية التوائم الجانبية.

تم الحفاظ على هيكل نمو الغدة النخامية المعزولة من الفأر P7 بشكل جيد. هنا ، تم عزل الغدة النخامية للفأر P21 بنجاح دون تلف مرئي أثناء إزالة الأنسجة المحيطة بها. في هذا الشكل ، يوضح تلطيخ H & E للأقسام الإكليلية الموجهة بشكل صحيح مورفولوجيا محفوظة جيدا لكل من الغدة الغدية والنقص العصبي في الغدد النخامية P0 و P7 و P21.

أخيرا ، كانت الشرائح المعالجة متوافقة أيضا مع وضع العلامات المناعي المضأل. على سبيل المثال ، أظهر الغدي والنقص العصبي وضع مناعي محدد ل GH و GFAP ، على التوالي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء العملية من التشريح إلى التضمين في 7.5 ساعة في الفئران البالغة وحتى أقل في الفئران الأصغر سنا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تشريح منطقة الغطاء بأكملها لتجنب لمس الغدة النخامية بأي أدوات جراحية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا عزل الغدة النخامية التي لم يتم تسبيتها مسبقا. في هذه الحالة ، يجب توخي المزيد من الحذر لتجنب أي ضرر غير مرغوب فيه.

يجب أيضا تشريح الغدة في أسرع وقت ممكن. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح الغدد النخامية للفأر وإعداد أقسام الغدة النخامية في مراحل النمو المختلفة.