تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد أسلاف الخلايا العصبية الداخلية القشرية في سلائف الخلايا العصبية الداخلية بعد الانقسامية للخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام جسم جنيني معدل إلى طريقة أحادية الطبقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيفية تحقيق الأنواع الفرعية من الخلايا العصبية الداخلية القشرية مصائرها الفردية أثناء النمو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح التوليد الفعال ل Nkx2.1 التي تعبر عن أسلاف الخلايا العصبية الداخلية ، بالإضافة إلى طرق إثراء المجموعات الفرعية للخلايا العصبية الداخلية للبارفألبومين أو السوماتوستاتين.

لبدء هذا الإجراء ، قم بوضع خلايا تغذية MEF غير النشطة انقساميا في وسائط MEF على الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة. اترك 12 ساعة على الأقل حتى يستقروا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية قبل طلاء mESCs. إذا لم يتم استخدامها على الفور ، فاستبدل وسائط MEF كل ثلاثة أيام.

بعد ذلك ، أضف mESCs التي تحتوي على عامل مثبط لسرطان الدم في الفأر إلى لوحات MEF. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتمرير mESCs باستخدام التربسين-EDTA بمجرد أن يصبح الطبق 70 إلى 80٪ ملتقى ، وحافظ على mESCs على طبقة تغذية MEF في وسائط mESC للحفاظ على تعدد القدرات.

قبل البدء في التمايز ، قم بتمرير الخلايا مرة واحدة على الأقل على ألواح مغلفة بالجيلاتين بدون MEFs لتخفيفها. للقيام بذلك ، قم بإعداد أطباق مغلفة بالجيلاتين عن طريق إضافة 0.1٪ جيلاتين و PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. اللوحة من 1.5 إلى مرتين 10 إلى الخلايا السادسة على كل لوحة عشرة سنتيمترات واسمح لها بالتوسع لمدة يومين قبل بدء التمايز.

في DD0 ، بعد أن تنمو mESCs على الألواح المطلية بالجيلاتين لمدة يومين ، قم بشفط الوسائط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف كمية كافية من التربسين-EDTA لتغطية سطح الألواح. وأعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع دقائق.

بعد أربع دقائق، قم بإخماد التربسين-EDTA باستخدام ضعف حجمه من وسائط mESC. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي بحجم مناسب ، وقم بالطرد المركزي للخلايا بمعدل 200 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنبوب وشفط الوسائط دون إزعاج الحبيبات.

أعد تعليق الحبيبات في مليليتر واحد من وسائط KSR-N2. بعد ذلك ، قم بقياس تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي. ابدأ في نمو الخلايا كأجسام جنينية عن طريق إضافة 75،000 خلية لكل مليليتر في وسائط KSR-N2 في أطباق زراعة الأنسجة غير الملتصقة.

واحتضنها عند 37 درجة مئوية. في DD1 ، استعد لهبوط الخلايا عن طريق طلاء الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة ب poly-L-lysine لمدة ساعة واحدة على الأقل أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في DD2 ، قم بشفط poly-L-lysine وقم بتغطية الألواح باللون اللامينين طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في DD3 ، قبل البدء في تفكك EB ، قم بشفط اللامينين واترك الألواح تجف تماما في غطاء زراعة الأنسجة. بعد ذلك ، انقل EB مع الوسائط إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي لمدة ثلاث إلى أربع دقائق عند 15 مرة جم أو حتى يتم تكوير EB. استنشق الوسائط ، وأضف ثلاثة ملليلتر من محلول انفصال الخلية الذي يحتوي على DNase.

ثم احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بنفض الأنبوب برفق كل ثلاث دقائق للمساعدة في تفكك الأنبوب الكهربائي. بمجرد أن تصبح EB غير مرئية ، أو انقضاء 15 دقيقة ، أضف ستة ملليلتر من KSR-N2 المحتوي على DNase ، وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 مرة جرام.

بعد ذلك ، قم بلوحة الخلايا في KSR-N2 التي تحتوي على LDN193189 ، XAV939 ، ومثبط ROCK ، Y27632 ، عند 4.5 إلى خمسة في عشرة في عشرة الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع. في DD5، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 التي تحتوي على FGF2 وIGF1 وSSH. بعد ذلك ، قم بإعداد ألواح زراعة الأنسجة لإعادة الطلاء في اليوم 8 ، باستخدام التعليمات الموضحة في الإجراءات الخاصة ب DD1 و DD2.

في DD7، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 التي تحتوي على FGF2 وIGF1 وSHH. في DD8 ، أعد طلاء الخلايا عن طريق فصلها عن الصفائح باستخدام التربسين EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإخماد التربسين-EDTA باستخدام ضعف حجمه مع KSR-N2.

وأجهزة الطرد المركزي عند 200 مرة غرام لمدة خمس دقائق. قم بتصفية الخلايا من خلال أنبوب مرشح 40 ميكرون لإزالة أي كتل. بعد ذلك ، أعد طلاء الخلايا عند 250 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع في N2-KSR تحتوي على FGF2 و IGF1 و Y27632 مع SHH.

في DD10، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على SHH. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، وأضف كاشف تفكك الخلايا الدافئ مسبقا وغير المحتوي على التربسين ، والذي يحتوي على DNase إلى الخلايا. ضعها في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 30 دقيقة ، أو حتى تنفصل الخلايا.

ثم اضغط برفق على الألواح كل خمس دقائق للمساعدة في التفكك. في DD5، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على FGF2 وIGF1. بعد ذلك ، قم بإعداد ألواح زراعة الأنسجة لإعادة الطلاء على DD8.

في DD7 ، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على FGF2 و IGF1. في DD8 ، أعد طلاء الخلايا بناهض ناعم وأضف مثبط PKC غير نمطي. في DD10، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على aPKCi.

في DD11 ، افصل الخلايا عن لوحات FACS. إذا لم يتم فصل الخلايا ل FACS على DD11 ، فقم بتغيير الوسائط على DD12 باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على aPKCi. في DD14، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على aPKCi.

وفي DD16 ، قم بتغيير الوسائط باستخدام KSR-N2 الذي يحتوي على aPKCi. ثم ، في DD17 ، اجمع الخلايا الإيجابية Nkx-2.1: mCheric. تظهر هنا الصور التمثيلية للتلوين المناعي ل Nkx2.1 و Nkx2.1: mCherry و Lhx6: GFP من ثقافة يوم التمايز 12.

لاحظ أن هذه الصور عبارة عن قنوات متداخلة من مجال الرؤية نفسه. يوضح هذا الرسم البياني القياس الكمي لمتوسط النسبة المئوية للنوى الموجبة DAPI التي تعبر عن Nkx2.1 عند DD12 في الثقافة. وهذه مخطط تمثيلي ل FACS ، يوضح مجموعات الخلايا الأربعة المختلفة التي يمكن عزلها باستخدام خط mESC المزدوج الخاص بنا.

لاحظ أن mCherry على المحور x ، و GFP على المحور y. وبالتالي ، فإن المربع العلوي الأيمن يمثل الخلايا التي تكون mCherry-GFP موجبة مزدوجة. فيما يلي المسار الزمني لتحريض Nkx2.1: mCherry و Lhx6: GFP من DD6 إلى 16 ، معبرا عنه كنسبة مئوية للخلايا في الثقافة التي إما mCherry تعبر فقط ، أو تعبير GFP فقط أو mCherry-GFP يعبر عن المشترك.

بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في غضون 17 يوما من البداية إلى النهاية ، إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تبدأ دائما بالخلايا الجذعية ذات القدرة المتعددة وغير المتمايزة وذات المظهر الصحي. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الزرع في القشرة المخية الحديثة للفأر حديثي الولادة أو البالغين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتحديد مصير الخلايا العصبية الداخلية أو تأثير زرع الخلايا العصبية الداخلية على وظيفة الدائرة وسلوك.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب التنموي لاستكشاف العوامل التي تدفع تحديد مصير الخلايا العصبية الداخلية في الفئران ، وبالتالي المرضى المصابين بالاضطرابات المتعلقة بالخلايا العصبية الداخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اشتقاق Nkx2.1 التي تعبر عن أسلاف ، وذريتها بعد الانقسام من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. شكرا على المشاهدة ، ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.