انقسام الخلية الثديية في مصفوفات ثلاثية الأبعاد عن طريق الفحص المجهري انعكاس [كنفوكل] الكمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة انقسام خلايا الثدييات وتفاعلات مصفوفة الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نهجا فعالا وعاما لدراسة انقسام خلايا الثدييات وتفاعلات مصفوفة الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية مثل الأساس الجزيئي لتطور الأنسجة الطبيعية والمرضية.

قبل يوم واحد من التعدي ، قم بلوحة خمسة ملايين خلية HEK-293 T في طبق زراعة خلية سعة 100 مل في 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا العادي. احتضان هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة رطبة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي قبل بدء التعدي مباشرة ، قم بإزالة قارورة كاشف التعدي من أربع درجات مئوية واتركها بالخارج لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم للبدء ، أضف ملليلترا واحدا من وسط المصل المخفض إلى أنبوب ميكروفوج معقم. إلى ذلك ، أضف كميات محددة من البلازميدات الناقلة الفيروسية المستخدمة في التعدي وتخلط عن طريق سحب العينات. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، أضف 48 ميكرولترا من كاشف التعدي إلى هذا الأنبوب واخلطه برفق عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، احتضن هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على خلايا HEK-293 T من الحاضنة.

أضف خليط كاشف تعداء الحمض النووي المحضر ، وقم بإسقاطه بشكل حكيم على الخلايا وقم بتدوير اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي في اللوحة. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. بعد حوالي ست ساعات من التعداء ، قم بإزالة اللوحة وشفط الوسط.

أضف 10 مل من وسط الاستزراع الطازج وانقل الطبق مرة أخرى إلى الحاضنة. في نقاط زمنية متعددة ، بعد 24 و 48 و 72 ساعة من التعدي ، قم بحصاد وسط الاستزراع الذي يحتوي على جزيئات الفيروسات العسقرية في أنابيب منفصلة. بعد ذلك ، قم بتصفية وسط الاستزراع المحصود من خلال مرشح معقم 0.45 ميكرون لإزالة الحطام الخلوي.

استبدلها بوسط استزراع طازج بعد كل حصاد. يمكن استخدام المرشح الذي يحتوي على جزيئات الفيروسات العدسية للنقل على الفور أو يمكن تخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لوحة خلايا سرطان الثدي البشري MDA-MB-231 في طبق مزرعة 35 ملم في وسط الثقافة العادي.

احتضان هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة رطبة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بشفط وسط الثقافة من اللوحة وأضف ملليلترا واحدا من جزيئات الفيروسات مع مليلتر واحد من وسط الاستزراع الطازج. احتضان الخلايا في الحاضنة لمدة 16 ساعة تقريبا.

بعد اكتمال الحضانة بالجزيئات الفيروسية ، قم بإزالة اللوحة لشفط الوسط. ثم أضف ملليلترين من الوسط الطازج وانقله مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 24 إلى 72 ساعة. تحقق من تعبير H2B-mCherry في هذه الخلايا المنقولة باستخدام مجهر التألق.

لبدء تجارب التزامن ، تعبر اللوحة الأولى عن خلايا MDA-MB-231 التي تعبر عن H2B-mCherry عند التقاء 50 إلى 60٪ في لوحة 24 بئرا. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استبدل وسط الاستزراع ب 0.5 مل من الوسط الذي يحتوي على اثنين من المليمولات ثيميدين.

اترك الطبق في الحاضنة لمدة 24 ساعة. بمجرد اكتمال الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لتحريرها من علاج الثايميدين. ثم اترك الخلايا في 0.5 مل من وسط الثقافة العادي لمدة خمس ساعات في الحاضنة.

بعد ذلك ، لمنع هذه الخلايا في الانقسام ، أضف Nocodazole إلى وسط الاستزراع. اترك الخلايا في الحاضنة لمدة 12 ساعة. بعد اكتمال علاج Nocodazole ، أخرج اللوحة وباستخدام شاكر مداري ، هز الخلايا لمدة 45 ثانية إلى دقيقة واحدة لتحرير الخلايا الانقسامية.

بعد ذلك ، قم بنقل الوسط الذي يحتوي على الخلايا الانقسامية المستخرجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد. ثم أضف 0.5 مل من الوسط الطازج إلى كل بئر. بعد ذلك ، كرر اهتزاز الخلايا واستخراجها مرتين أخريين.

قم بتجميع الوسط الكلي الذي تم جمعه ثم قم بطرده لتكويب الخلايا الانقسامية. بعد الدوران ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.25 مل من وسط زراعة الخلايا الطازجة. باستخدام مقياس كثافة الدم ، احسب عدد الخلايا.

في بداية هذه الخطوة ، قم بإعداد 50 مل من محلول 10x DMEM وقم بتعقيمه. بعد ذلك ، حدد أحجام جميع المكونات التي سيتم استخدامها لصنع مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد كما هو محدد في بروتوكول النص. قم بتبريد كل هذه المكونات مسبقا على الجليد لإبطاء هلام الكولاجين.

الآن ، إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا سعة 1.5 مليلتر ، أضف الأعداد المطلوبة من الخلايا في الوسط ثم 10x DMEM و FBS والماء منزوع الأيونات والكولاجين وأخيرا هيدروكسيد الصوديوم. تخلط بعناية باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد. بمجرد خلط المحلول جيدا ، أضف 500 ميكرولتر من الخليط في كل بئر من الطبق المكون من 24 بئرا.

ضع الطبق المكون من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة ، أخرج الطبق وأضف 500 ميكرولتر من وسط الثقافة الدافئ مسبقا فوق الجل. قبل التصوير ، قم بتشغيل وحدات الخلايا الحية لتباين الطور والمجاهر متحد البؤر.

لالتقاط الخلايا المنقسمة ، ضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على الخلايا المضمنة في مصفوفات الكولاجين في وحدة الخلية الحية في المجهر الفلوري. باستخدام هدف 10X ، ابحث عن الجزء السفلي من اللوحة ثم حركه لأعلى حتى يركز المجهر على حوالي 500 ميكرومتر من أسفل اللوحة. حرك المرحلة للعثور على الخلايا في مراحل مختلفة من الانقسام وحدد مواضع متعددة للتصوير.

قم بإعداد تجربة اللقطات المتتابعة بفواصل زمنية مدتها دقيقتان. بعد ذلك ، لتصوير شبكة الكولاجين ، قم بتكوين المجهر متحد البؤر لالتقاط الضوء المنعكس فقط من الليزر 488 نانومتر. ثم ضع اللوحة التي تحتوي على خلايا في مصفوفات الكولاجين في وحدة الخلية الحية لهذا المجهر.

أوجد الجزء السفلي من اللوحة ثم حرك العدسة الموضوعية لأعلى حتى تركز على حوالي 100 ميكرومتر من أسفل اللوحة. حرك المسرح للعثور على الخلايا وحدد مواضع متعددة للتصوير. قم بإعداد تجربة الفاصل الزمني بفواصل زمنية مدتها خمس دقائق.

هنا صور الفلورسنت لخلية H2B-mCherry المنقسمة التي تعبر عن خلية MDA-MB-231 المضمنة في مصفوفة الكولاجين. يتم ملاحظة مراحل مختلفة من الانقسام بسهولة كما هو متوقع. يتغير توزيع ألياف الكولاجين باللون الأبيض في وقت واحد باستخدام الفحص المجهري للانعكاس متحد البؤر بشكل ضئيل جدا أثناء الانقسام.

المرحلة المتزامنة للخلية G2-M والمضمنة في مصفوفة الكولاجين تقسيما كاملا للخلايا في أول ساعتين بينما تنقسم الخلايا غير المتزامنة بشكل عشوائي. يشير القياس الكمي لتوزيع ألياف الكولاجين أثناء الطور البيني والانقسامي إلى أن تشوه المصفوفة يكون ضئيلا أثناء انقسام الخلية وأعلى في خلايا الطور البيني. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في سبعة أيام بدءا من إنشاء خط الخلية المستقر إلى تحليل انقسام خلية الفيديو في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مزامنة ومراقبة انقسام خلايا الثدييات في مصفوفات ثلاثية الأبعاد باستخدام تصوير الخلايا الحية وكيفية تحديد تشوه المصفوفة باستخدام الفحص المجهري للانعكاس متحد البؤر وتقنيات تحليل التصوير الكمي.