بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسهيل التحويل الخلوي المسبق السريع والقابل للتكرار للأحبار الحيوية لتطبيقات الطباعة الحيوية مع الحفاظ على بقاء الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تبسيط وتحسين قابلية التكاثر عند مزج تعليق الخلية بالحبر الحيوي لضمان طباعة الخلايا القابلة للحياة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تلغي قدرتنا على الخلط عن طريق مزج الخلايا بالحبر الحيوي في نظام مغلق مع الحد الأدنى من المناولة وخطر فقدان العينة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يوجد خطر الخلط غير السليم إذا تم إجراء التجميع بشكل غير صحيح. للبدء ، احصل على حقنتين. حقنة واحدة مخصصة لتعليق الخلية بينما المحقنة الأخرى للحبر الحيوي.

نسبة الخلط المستخدمة في هذه الدراسة هي 10 إلى واحد. لذلك ، استخدم حقنة سعة 12 مليلتر وحقنة سعة مليلتر واحد ، كما هو مطلوب من قبل وحدة الخلط من 10 إلى واحد. أيضا ، احصل على وحدة خلط سلبية معقمة يمكن أن تقترن بمحاقن مزدوجة عبر وصلة قفل لور وموصل قفل لور معقم بين أنثى الأنثى.

استرجع وحدة توزيع يمكنها بثق حجم من حقنتين معقمتين في وقت واحد بمعدل متحكم فيه. أخيرا ، احصل على خرطوشة معقمة لخلط الحبر الحيوي وتعليق الخلية مباشرة. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام حبر حيوي قائم على ألجينات السليلوز النانوية ، والذي يتم ربطه من خلال إضافة محلول كلوريد الكالسيوم بعد الطباعة.

لتحضير الخلايا ، افصلها باستخدام محلول 0.5٪ تريبسين EDTA. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الخلايا الليفية البشرية. بعد ذلك، احسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام طريقة استبعاد trypan blue.

حدد كثافة الخلية المطلوبة في البناء المطبوع النهائي. احسب تركيز الخلايا المحصودة التي يجب تخفيفها لتحقيق كثافة الخلية النهائية المستهدفة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام كثافة خلية نهائية تبلغ خمسة ملايين خلية لكل مليلتر.

انقل معلق الخلية إلى حقنة تعليق الخلية. انقل الحبر الحيوي أيضا إلى المحقنة الأخرى. بعد ذلك ، اسحب مكبس حقنة الحبر الحيوي للخلف وأدخل المحقنة في وحدة التوزيع.

تأكد من أن نصف الحجم على الأقل في المحاقن المنسدلة للخلف هو هواء معقم من داخل خزانة السلامة الحيوية. من المهم الحفاظ على مواضع غطاسات الحقن أثناء الإدخال في وحدة التوزيع. ضع الوحدة عموديا مع موصل قفل اللور لأعلى.

ثم اسحب مكبس حقنة الخلية مرة أخرى إلى طول مماثل لحقنة الحبر الحيوي وأدخلها في وحدة التوزيع. تأكد من عدم وجود تفريغ عرضي لتعليق الخلية أو الحبر الحيوي عن طريق التأكد من توصيل وحدة الخلط بالتساوي بالحقنتين. تحقق مرة أخرى قبل الخلط.

قم بتوصيل كلتا المحاقن بوحدة الخلط عن طريق لف موصلات قفل لور. ثم قم بتجهيز نظام الخلط عن طريق الضغط على وحدة الاستغناء لبثق الهواء في المحقنة. أوقف التحضير قبل وصول المحلول إلى قفل luer.

بعد التحضير ، قم بتوصيل خرطوشة التعبئة بنهاية وحدة الخلط عبر موصل قفل لور. تأكد من أن المكبس الموجود في خرطوشة التعبئة في الأسفل قبل التوصيل. قم بضغط وحدة التوزيع ببطء لخلط الحبر الحيوي وتعليق الخلية معا في الخرطوشة.

ادفع المكبس الموجود في خرطوشة التعبئة لأسفل باستخدام طرف ماصة معقم لملامسة خليط خلايا الحبر الحيوي بعد الخلط. حافظ على وحدة التوزيع مضغوطة لضمان عدم بثق خليط الحبر الحيوي للخلية مرة أخرى في وحدة الخلط. قم بتغطية الخرطوشة واضغط برفق على سطح العمل لنقل أي فقاعات هواء إلى أعلى الخرطوشة.

في هذه المرحلة ، يكون خليط الحبر الحيوي للخلية جاهزا للطباعة. في هذا البروتوكول ، تم تصدير هيكل مربع بأبعاد 4.8 × 4.8 × 0.9 مليمتر مكعب كملف طباعة حجرية مجسمة تم إنشاء ملف g-code لبنية الشبكة باستخدام الإعدادات الموجودة في بروتوكول النص.

عزل الخلايا الغضروفية الأنفية البشرية الأولية ، أو HNCs ، من المرضى وحفظها بالتبريد ، باتباع البروتوكول المشار إليه. قم بإذابة وتوسيع المواد الحلقية الحلقية المحفوظة بالتبريد وتوسيعها مرة واحدة في ثقافة أحادية الطبقة باستخدام وسط الاستزراع القياسي عند 37 درجة مئوية. افصل الخلايا عند التقاء 80٪ إلى 90٪ باستخدام محلول EDTA 0.5٪ تريبسين وعدها باستخدام بروتوكول استبعاد trypan blue.

أجريت جميع التجارب باستخدام HNCs في المقطع الثاني. نقوم بتعليق HNCs عند 100 مليون خلية لكل مليلتر في غضون 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، مع استكمال 10٪ مصل بقري الجنين ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، و 50 ميكروغرام لكل مليلتر من حمض الأسكوربيك استعدادا للمزج مع الحبر الحيوي. امزج معلق الخلية HNC في حبر حيوي قائم على ألجينات السليلوز النانوي ، باتباع بروتوكول وحدة الخلط السلبي عند نسبة 10 إلى 1 حبر حيوي إلى نسبة تعليق الخلية ، للحصول على تركيز خلية نهائي يبلغ تسعة ملايين خلية لكل مليلتر.

تأكد من تعقيم الطابعة الحيوية عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية وامسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول. حافظ على العقم عن طريق وضع الطابعة الحيوية في خزانة التدفق الصفحي. ثم قم بتوصيل فوهات الطباعة المعقمة بالخراطيش التي تحتوي على خلطات تعليق خلايا الحبر الحيوي وإدخالها في الطابعة الحيوية.

بعد معايرة الطابعة الحيوية ، قم بطباعة الخلايا المبنية الشبكية المحملة باستخدام فوهة مخروطية قياس 25 عند ضغط 25 كيلو باسكال. Bioprint خالية من الخلايا كعنصر تحكم. ربط التركيبات عن طريق إضافة محلول أيوني من 100 ملليمر أو كلوريد الكالسيوم.

بعد خمس دقائق ، اشطف البنيات. ثم احتضان التركيبات في وسط الاستزراع في ظل ظروف الاستزراع القياسية ، وتغيير الوسائط كل يومين أو ثالثين. اجمع العينات للتحليل النسيجي في الأسبوعين الثاني والرابع.

بتلطيخ العينات من أجل إنتاج الجليكوزامينوجليكان ، أو إنتاج GAG ، باستخدام بقعة زرقاء ألسيا. يظهر هنا صلاحية الخلية بعد 24 ساعة من الخلط مع وحدة الخلط السلبية أو تقنية الخلط اليدوي. أظهرت وحدة الخلط السلبي قابلية أفضل للحياة ، حيث تم زيادة مدى الخلط.

هذا مهم لأن أوقات الخلط الأطول قد تكون ضرورية عند تحضير دفعات كبيرة من الأحبار الحيوية السابقة للخلية. تظهر هنا صلاحية الخلية في اليوم 14 واليوم 28 من الثقافة. يتم تصور الجدوى الجيدة للخلية ، مما يدل على بقاء الخلية على المدى الطويل عند استخدام هذه التقنية.

يتم تصور الجليكوزامينوجليكان في تركيبات الغضروف المطبوعة بيولوجيا ، ملطخة باستخدام أزرق الألسيا ، في الأيام صفر ، واليوم 14 ، واليوم 28. توضح هذه الصور تكوين الغضروف الجديد داخل هذه التركيبات المطبوعة بيولوجيا. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام وحدة الخلط السلبي لإضفاء الطابع الخلوي على الأحبار الحيوية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطباعة الحيوية لخلية الأحبار الحيوية بسرعة وبشكل موحد باستخدام تقنية خلط لطيفة.