إشارات جيل التوافقي الثاني في أرنب الصلبة كأداة للتقييم للأنسجة العلاجي العابرة للربط (TXL) لقصر النظر

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إثبات استخدام الفحص المجهري من الجيل الثاني التوافقي لتصور وقياس تأثير الربط المتقاطع للكولاجين في الأنسجة الصلبية كما هو ناتج عن حقن اللسان الفرعي لعامل إطلاق الفورمالديهايد ، وكما تم التأكيد عليه من خلال كالوريمتر المسح التفاضلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تشابك الأنسجة العلاجية من خلال توفير طريقة غير جراحية لتقييم تأثيرات التشابك المستحثة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الإشارات التوافقية الثانية التي تم إنشاؤها محددة للغاية للألياف المجمعة ، وعلى هذا النحو ، لا يلزم تحضير خاص للأنسجة ، مثل تلطيخ الأجسام المضادة.

خطرت لنا هذه الفكرة لأول مرة عن هذه الطريقة عندما قرأنا عن الإجراء الذي يتم تطبيقه على تشابك أنسجة القرنية العلاجية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الفحص المجهري الناجح للجيل التوافقي الثاني يتطلب وضعا دقيقا للأنسجة ووضع ظروف التصوير الصحيحة لمنع تلف الأنسجة والقطع الأثرية في قياس الإشارة. ابدأ العلاج بحقن اللسان الفرعي في مقل عيون الأرنب كما هو موضح في بروتوكول النص.

أظهر هنا تمثيلا تخطيطيا لموقع حقن اللسان الفرعي. حدد منظارا بالحجم الأمثل وفقا لحجم العين. بعد ثلاث ساعات ونصف من الحضانة ، اسحب الجفون باستخدام منظار الجفن لتحسين الوصول إلى الكرة الأرضية.

افصل الملتحمة المحيطة بالنسيان وقطع عضلات العين الزائدة في مواقع إدخال الصلبة. قم بقص الجزء العلوي من الصلبة باستخدام مقص أو شفرة لإنشاء مساحة واحدة تلو الأخرى مع موقع الحقن في المركز. اكشطي طبقات الشبكية والمشيمية المتبقية واغسليها مرتين باستخدام PBS الطازج ، في كل مرة اترك القطع في محلول لمدة 10 ثوان تقريبا.

ضع الأنسجة في أنابيب مليلتر واحدة مملوءة بمحلول PBS لنقلها إلى منشأة التصوير. لتعظيم الإشارة والدقة عند إجراء الفحص المجهري SHG ، استخدم عدسة موضوعية محسنة لنقل ضوء الأشعة تحت الحمراء ، وبفتحة عددية عالية. اضبط طوق تصحيح العدسة ليتناسب مع عمق العينة.

في هذه الحالة ، 0.17 ملم. قم بتركيب العدسة الموضوعية 25 مرة على المجهر وأضف كمية وفيرة من جل الغمر المائي لتغطية سطح العدسة. من المهم إجراء تصوير الأنسجة في غضون 30 دقيقة من تركيب العينة على المجهر من أجل الحفاظ على رطوبة الأنسجة ومنع جفاف جل الغمر بين هدف العدسة والشريحة ، حيث سيؤدي ذلك إلى تغييرات في إشارة SHG.

قم بتجميع حجرة الخلية عن طريق وضع زلة غطاء دائرية مقاس 25 ملم على الجزء السفلي من الغرفة. ضع قطعة من أنسجة الصلبة على زلة الغطاء وأضف 50 إلى 100 ميكرولتر من العازلة. قم بتغطية المنديل بزلة غطاء دائرية ثانية وقم بالمسمار في الجزء العلوي من الغرفة دون الضغط على الأنسجة أو تسطيحها.

ثم قم بتركيب حجرة الخلية بعينة الأنسجة على مرحلة المجهر. ضع المسرح واضبط ارتفاع الهدف بحيث يكون السطح السفلي للعينة في بؤرة التركيز على النحو الذي يحدده فحص المجال الساطع من خلال قطعة العين. أطفئ جميع الأضواء باستثناء شاشة الكمبيوتر ، وحجب أكبر قدر ممكن من الضوء من الشاشة باستخدام صفائح رقائق الألومنيوم الملفوفة على مرحلة المجهر.

في البرنامج ، قم بإيقاف تشغيل وضع Eye Port. في لوحة TI Pad، تحقق من صحة تعريف العدسة. في لوحة واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1 ، اختر ليزر الأشعة تحت الحمراء للتصوير ، وحدد أجهزة الكشف غير الممسوحة ضوئيا ، واختر قناة DAPI المزودة بمرشح تمرير نطاق 400 إلى 450 نانومتر.

في لوحة واجهة المستخدم الرسومية A1 Multi Photon ، اضبط الطول الموجي لليزر بالأشعة تحت الحمراء على 860 نانومتر وافتح الغالق. انتظر حتى يتغير الطول الموجي للانبعاث كما هو موضح في الضوء الأخضر الثابت. لتعيين ظروف المسح الضوئي بالليزر في لوحة واجهة المستخدم الرسومية المدمجة مقاس A1، حدد ماسح ضوئي Galvano، والمسح الضوئي الاتجاهي للوحدة، وحجم إطار 1024 × 1024 بكسل، ووقت مكوث البكسل 6.2 ميكروثانية، ومتوسط الخط 2X.

بعد ذلك ، قم بتشغيل التخيل المباشر باستخدام وضع البحث ، واضبط ظروف التخيل في لوحة واجهة المستخدم الرسومية المدمجة الذكاء الاصطناعي عن طريق ضبط طاقة الليزر وكسب الكاشف. اضبط طاقة الليزر بين 50 مللي واط و 150 مللي واط ، أي ما بين اثنين بالمائة وستة بالمائة لليزر عند 860 نانومتر. فوق هذا النطاق يمكن أن يحدث تلف الأنسجة.

افتح لوحة جدول البحث التي تعرض مخططا تكراريا لقيم كثافة البكسل في الصورة الحالية، وقم بضبط كسب الكاشف بشكل أكبر في الشريط المسمى HV لزيادة نطاق قيم البكسل مع تجنب التشبع. استخدم العينة التي تحتوي على أعلى إشارة SHG للعثور على إعدادات الليزر والكسب المثلى. الحفاظ على إعدادات متطابقة لجميع العينات لتتم مقارنتها في تجربة واحدة.

تضمن هذه الممارسة عدم تشبع أي عينة في التجربة الكاشف. لفحص الأنسجة في وضع المعاينة، افتح أداة نظرة عامة على XYZ. اضبط التصوير على دقة أقل لتسريع الحصول على الصور في هذا الوضع.

في لوحة نظرة عامة على XYZ ، انقر بزر الماوس الأيمن على الموضع الحالي وحدد المسح الضوئي خمسة في خمسة أو ثلاثة في ثلاثة أو التقاط عرض واحد. بعد الانتهاء من المسح، انتقل إلى موقع جديد بالنقر المزدوج على منطقة خارج المنطقة الحالية المعينة. قم بتشغيل وضع المسح المباشر ، ثم اجعل الأنسجة في التركيز حيث يمكن أن يكون للمناطق المختلفة من الأنسجة مواضع مختلفة قليلا في الاتجاه المحوري.

التقط حقول رؤية جديدة خمسة في خمسة أو ثلاثة في ثلاثة أو مفردة. كرر هذه العملية حتى تتم معاينة مساحة كبيرة من الأنسجة. في أداة نظرة عامة على XYZ ، انقر نقرا مزدوجا فوق موضع تظهر فيه ألياف الكولاجين في مجال الرؤية بأكمله لنقل المسرح إلى هذا الموقع المحدد.

اضبط التصوير على دقة عالية ، 1024 × 1024 بكسل ومتوسط خطي 2X. قم بتشغيل وضع البحث المباشر ، واضبط موضع الهدف بحيث يكون الساهل السفلي في بؤرة التركيز ، وفي TI Pad ، استخدم Z Drive لتحريك المستوى البصري 10 ميكرومتر فوق هذه الطبقة السفلية. احصل على صورة باستخدام زر الالتقاط ، واحفظ الموقع باستخدام زر علامة الجمع في أداة مراجعة XYZ.

انقر نقرا مزدوجا فوق موقع جديد وكرر عملية ضبط العمق والتقاط الصورة. لكل قطعة من الأنسجة ، التقط 10 صور. يجب ألا تتداخل حقول العرض كما هو موضح في المواقع المحفوظة في أداة نظرة عامة على XYZ.

أخيرا ، ضع القطع الصلبية في أنبوب مليلتر واحد مع PBS مباشرة بعد اكتمال الفحص المجهري استعدادا لتحليل كالوريمتر المسح التفاضلي اللاحق. للبدء ، قم بقطع الجزء المركزي من التحكم ومعالجة الصلبة بالمقص. جفف كل مربع صلبي بأنسجة ماصة وضعه بشكل مسطح في قاع وعاء DSC باستخدام ملقط مسنن.

مع تجعيد الأنسجة بالداخل والشفاه وتغطيتها ، قم بوزن المقلاة للحصول على الوزن الرطب للنسجة. بعد ذلك، ضع العينة الموزونة في موقعها المحدد على درج جهاز أخذ العينات الآلي DSC. قم بإنشاء طريقة باستخدام برنامج إدارة الأدوات ، وتحديد وزن الأنسجة وتشغيل التحليل الحراري باستخدام المحيط المدرج في بروتوكول النص.

بمجرد الانتهاء ، قم بتحليل البيانات لكل عينة عن طريق استخراج ذروة درجة الحرارة الانتقالية التي يحدث عندها التمسخ الحراري باستخدام برنامج التصوير الأدوات. تم تحليل صور SHG للصلبة في فيجي لمتوسط سطوع البكسل. عند فتح صورة وتحديد قائمة التحليل متبوعة بالقياس ، يفتح جدول يحتوي على متوسط سطوع الإشارة.

بدلا من ذلك، في القائمة تحليل، يتم تحديد الرسم البياني لإنشاء رسم بياني لقيم شدة البكسل التي تحتوي على معلومات حول متوسط سطوع الإشارة وتباينها في الصورة. تكرر هذا القياس لجميع الصور من العينات الضابطة والعينات المترابطة. يتم توضيح صور SHG التمثيلية للصلبة مع تحليل الرسم البياني المصاحب ، بما في ذلك متوسط السطوع ، هنا.

تتميز عينة التحكم بترتيب متموج من الألياف. تظهر هنا عينة متشابكة مع 400 مللي مولار SMG مع زيادة كثافة البكسل التي تكشف عن ألياف الكولاجين التي تبدو أكثر استقامة. تظهر نتائج التحليل الحراري الذروة الأعلى لدرجة حرارة التمسخ وتؤكد تأثير الربط المتقاطع

عرض عينة التحكم ومنحنى تمسخ العينة المتشابك 400 ملليمولار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينة متشابكة ، وكيفية إجراء الفحص المجهري SHG على عينات الصلبة. بشكل عام ، يعاني الأفراد الجدد على هذه الطريقة من الحقن الدقيق في مساحة اللسان الفرعي ، واستخراج المربع حول موقع الحقن جراحيا وضبط ظروف الصور لمسح الأنسجة في وضع المعاينة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل autoluorescence من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تحليل الإيلاستين بما في ذلك القياس الكمي والمورفولوجيا. تمتد الآثار المترتبة على تقنية توصيل عامل الربط المتقاطع هذه إلى علاج قصر النظر المرتفع والورم العنقودي الخلفي ، لأنها توفر وصولا أسهل إلى القطب الخلفي لغرض تثبيت الصلبة. تمتد الآثار المترتبة على تقنية الفحص المجهري هذه إلى تشخيص قصر النظر المرتفع والمضاعفات الناجمة عن ضعف الكولاجين عن طريق قياس حالة الارتباط المتقاطع للكولاجين في الصلبة المريضة ، أو عن طريق قياس النتيجة بعد اكتمال إجراء الربط المتبادل المطلوب.

لذلك ، يمكن أن توفر طريقة الربط المتقاطع هذه والفحص المجهري للجيل التوافقي الثاني نظرة ثاقبة للربط المتقاطع للصلبة ، ويمكن أيضا تطبيقها على الأنسجة الأخرى مثل القرنية والجلد والغضاريف والأوتار وصمام القلب والأوعية الدموية.