أسلوب ثقافة بديلة للحفاظ على هيبوميثيليشن الجينية للخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 وفيتامين (ج)

وصفت لنا بالتفصيل البروتوكولين على أساس المادة الكيميائية لاستزراع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. ويستخدم هذا الأسلوب الجديد التآزري آليات تعزيز أكسدة تيت بوساطة (بفيتامين ج) وقمع حيثياته توليف 5-ميثيلسيتوسيني (حسب PD0325901) للحفاظ على الحمض النووي هيبوميثيليشن وبلوريبوتينسي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام مركبات الجزيئات الصغيرة PD0325901 وفيتامين ج للحفاظ على حالة نقص الميثيل ومتعددة القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية الجنينية للفئران المستزرعة من FBS ، مثل عدم التغاير في التشكل وإزالة فرط الميثيل. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا الجذعية الجنينية للفأر قادرة على الحفاظ على مورفولوجيا ممتازة والحالة المنخفضة والميثيل وغير المتمايزة.

بعد تحضير الألواح والمخازن المؤقتة ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسخين خلايا ES للفأر ، ووسط الثقافة ، والتربسين ، و PBS في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. لتمرير الخلايا ، قم بشفط الوسط من الطبق واستخدم ملليلترين من PBS لشطف الخلايا مرتين. ثم قم بإزالة PBS وأضف 0.3 مل من التربسون EDTA إلى الخلايا وقم بإمالة الطبق بسرعة لتغطية الخلايا في المحلول.

قم بإزالة التربسين على الفور واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لفصل الخلايا. أضف ملليلترين من وسط المصل الدافئ مسبقا لتعطيل التربسين واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لإعادة تعليق مستعمرات الخلايا 10 مرات في معلق خلية واحدة. ضع 150 ميكرولترا من محلول الخلية في طبق جديد مغطى بالجيلاتين بسعة ستة سنتيمترات ومكمل بثلاثة ملليلتر من VCPD0325901 المتوسط الطازج.

استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بسبب عدم استقرار Vc ، كل 24 ساعة أثناء الحضانة ، قم بإزالة وسط الاستزراع القديم وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط Vcpd0325901 الطازج. بعد الوصول إلى 70 إلى 80 في المائة من التقاء ، قم بتمرير الخلايا واستمر في زراعتها كما هو موضح للتو.

لإجراء استخراج الحمض النووي ، اجمع الخلايا باستخدام التربسين كما هو موضح سابقا واستخدم مجموعة تنقية الحمض النووي الجيني باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أضف 100 ميكرولتر من الماء فائق النقاء إلى أنبوب الحمض النووي وقم بإذابة الحمض النووي عن طريق سحب العينات 15 مرة تقريبا. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس نسبة Od260 إلى 280 لتحديد تركيز وجودة الحمض النووي.

يجب أن يكون تركيز الحمض النووي حوالي 500 نونوغرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بهضم خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي عن طريق دمجه مع خمسة ميكرولتر من 100 ملليمولار تريس هيدروكلوريد PH7.6 ، ووحدتين من الفوسفاتيز المعوي في العجل ، ووحدة واحدة من Dnase واحد ، و 0.005 وحدة من سم الثعبان ، فوسفوديستراز واحد. بعد ذلك ، استخدم الماء النقي للغاية لرفع الحجم إلى 50 ميكرولترا.

احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اجمع العينة عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 000xg في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ثم انقل المحلول إلى أنابيب ترشيح فائقة وقم بتدوير العينات عند 13 و 000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة إنزيمات الهضم.

لتحضير العينات لتحليل 5HMC ، قم بنقل 36 ميكرولترا من المرشح إلى أنبوب جديد سعة مليلتر واحد وأضف أربعة ميكرولترات من D35HMC للتركيز النهائي لثلاثة نانو ضرارية. لتحليل 5MC ، قم بإدخال 196 ميكرولترا من الماء النقي للغاية في أنبوب طرد مركزي جديد وأضف أربعة ميكرولترات من الترشيح بسبب الكثافة العالية ل 5MC في الحمض النووي الجيني. انقل 36 ميكرولترا من محلول 5MC المخفف إلى أنبوب طرد مركزي جديد وأضف أربعة ميكرولترات من D35MC للحصول على تركيز نهائي يبلغ 50 نانو مولار.

استخدم D35HMC و D35MC كمعايير داخلية لمعايرة 5HMC و 5MC على التوالي. بعد إعداد المعلمات لتحليل 5MC و 5HMC في برنامج UHPLCMS ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بإنشاء معلمات QQQMSMS بالنقر فوق MS QQQ. لوقت التوقف، اختر بلا حد/كمضخة.

بالنسبة لمصدر الأيونات، اختر ESI. لتصفية الوقت، حدد عرض الذروة وأدخل 0.07 دقيقة. لإعداد الشرائح الزمنية، بالنسبة إلى وقت البدء، اختر صفرا.

لتعيين وضع المسح الضوئي في MRM لتحليل التلميح من العمود، لنوع المسح الضوئي، اختر MRM. بالنسبة إلى قيمة div ، اختر To MS. بالنسبة إلى Delta EMV plus، أدخل 200 وبالنسبة إلى Delta EMV ناقص، أدخل صفر. قم ببناء معلمات مراقبة الانتقالات بالنقر أولا فوق اكتساب MSQQQ واحد.

لتعيين مقاطع المسح الضوئي، بالنسبة إلى المسكن، أدخل 90. لضبط الفولتية الجزئية ل Fragmentor ، أدخل 90. بالنسبة لطاقة التصادم ، أدخل خمسة.

بالنسبة لجهد مسرع الخلية، أدخل أربعة. لضبط وضع الأيونات الموجب ، بالنسبة إلى Polarity ، اختر إيجابي. لإجراء فصل UHPLC من أحادي النوكليوسيدات ، قم بإعداد المحاليل أ و ب للتلميح إلى 5MC والسيتوزين عن طريق خلط 500 مل من الماء فائق النقاء مع 500 ميكرولتر من حمض الفورميك للمحلول أ.

ثم قم بقياس 500 مل من الميثانول بنسبة 100 في المائة والمحلول ب. امزج المحلول أ والمحلول ب بنسبة 95 إلى خمسة حجم إلى الحجم كمرحلة متنقلة لاستخلاص 5MC و C. ثم اضبط معدل التدفق على 0.25 مل في الدقيقة. افصل 5HMC باستخدام تلميح تدرج محسن.

ثم اضبط معدل التدفق على 0.25 مل في الدقيقة. راقب التحولات ل 5MC و D35MC و DC و 5HMC و D35HMC. اضبط الفولتية الشعرية على 3 ، 500 فولت.

ثم اضبط حجم الحقن على 5 ميكرولتر وحلل كل عينة ثلاث مرات. استخدم المنحنيات القياسية المقابلة لتقييم مقدار 5MC و 5HMC وفقا لبروتوكول النص. كما رأينا في هذا التحليل للحمض النووي الجيني في خلايا ES للفأر بواسطة UHPLC MSMS ، أدى علاج VcPD0325901 إلى انخفاض أسرع في مثيلة الحمض النووي ووصل إلى خمسة مستويات ثابتة من MC بعد خمسة أيام ، بينما أدى علاج Vc 2i إلى مستوى مماثل في اليوم 11.

يوضح هذا الرسم البياني أن العلاج المحتوي على Vc زاد بشكل كبير من تردد 5HMC بعد يوم واحد وبعد ذلك ، انخفضت مستويات 5HMC تدريجيا بسبب الانخفاض التدريجي في ركيزة 5MC. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن Prdm14 كان مرتفعا بشكل كبير ، في حين أن Dnmt3b والعامل المساعد له ، Dnmt3l ، تم تنظيمهما بشكل كبير عندما تراجعت الخلايا مع PD0325901 ، مما يشير إلى عمل PD0325901 في محو 5MC. في مقايسة الفوسفاتيز القلوية هذه ، كانت جميع خلايا الفئران الجذعية الجذعية ملطخة باللون الأرجواني بمورفولوجيا تشبه الكرة عند زراعتها لمدة 26 يوما في VcPD032590 ، مما يشير إلى حالة غير متمايزة.

في المقابل ، ظهرت الخلايا المزروعة في FBS التي تحتوي على وسط وحده فاتحة اللون مع انتشار جزئي يشير إلى التمايز الجزئي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن FBS يحتاج إلى فحص مسبق.

أيضا ، تجنب الإفراط في سحب الخلايا عبر الممر وتغيير وسط الثقافة VcPDO325901 يوميا. بعد هذا التطور ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال زراعة خلايا الفئران الجنينية في المختبر لاستكشاف تطور وعمليات الأجنة في المختبر والخلايا المتولدة ذات الصلة الطبية للطب التجديدي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أكبر لكيفية الحفاظ على مورفولوجيا النمو والحالة القوية المفرطة والميثيل والجمع لخلايا ES للفأر باستخدام مكونين جزيئيين صغيرين ، مثبط MEK ، PD0325901.

لا تنس أن العمل مع Trisol أو DMS أو PMS و DTT يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والقناع والنظارات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.