الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا عن تعليق الخلية من أجل إتاحتها لتحليل خلية واحدة في اتجاه مجرى النهر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في سياق الخزعات السائلة وعدم التجانس الخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل الخلايا المفردة القائم على الأجسام المضادة واستعادتها للتحليل الجيني الجزيئي اللاحق على مستوى الخلية الواحدة.

بمجرد السماح باستخدامها في المرضى ، ستمكن هذه التقنية من توصيف الخلايا السرطانية المنتشرة من مرضى السرطان. نظرا لأن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لعدم التجانس بين الخلايا المفردة ، فيمكن تطبيقها على جميع أنواع معلقات الخلايا التي تحتوي على مجموعات سكانية فرعية مثل عينات الدم أو عينات من مزارع الخلايا أو الأنسجة والأعضاء المنفصلة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما استخدمنا جهاز تخصيب في الجسم الحي غير قادر على إطلاق الخلايا لغرض التحليل النهائي.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تنفيذ خطوات حصاد الخلايا المفردة باستخدام التشريح الدقيق بالليزر أو المعالجة الدقيقة بنجاح لأن عملية حصاد الخلايا المفردة عرضة لفقدان الخلايا وتتطلب مستوى عال من الخبرة. في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا ، قم بتعليق الخلايا المسماة HT-29 CFSE واتركها تتجدد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لحصاد الخلايا ، جهاز الطرد المركزي عند 300 غرام لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من محلول تلطيخ الحمض النووي Hoechst 33342 الجاهز للاستخدام عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في أربعة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X.

بعد ذلك ، احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وتحقق من وضع العلامات الفلورية باستخدام المجهر الفلوري. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات عند حوالي 500 ، 000 خلية لكل مليلتر ووضع الخلايا على الجليد. في خمسة ملليلتر من الدم المحيطي ، أضف حوالي 500 إلى 500،000 خلية ثم اخلطها عن طريق قلب الأنبوب.

بعد إزالة السلك من حجرة التخزين ، قم بإزالة الغطاء المطاطي الذي يحمل السلك واغسل السلك بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X وقم بتثبيته في غطاء الأنبوب. بعد ذلك ، قم باحتضان الأنبوب على خلاط أسطواني مائل بخمس دورات في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اشطف السلك في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بتخزين السلك في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X في الظلام. ارسم منطقة مستطيل على شريحة زجاجية باستخدام قلم شحوم ، ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X عليها. لغمر الجزء الوظيفي من السلك في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X ، قم بثني الجزء غير الوظيفي من السلك وضعه على الشريحة الزجاجية.

لحساب عدد الخلايا الملتقطة ، افحص جانبي السلك بصريا. بعد الفحص ، انقل السلك مرة أخرى في أنبوب سعة 15 مليلتر مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X واحتفظ به في الظلام. في مليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X ، قم بإذابة أربعة ملليغرامات من مكون المخزن المؤقت للتحرير ، ثم قم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر للحصول على المخزن المؤقت الجاهز للاستخدام.

بعد ذلك ، قم بتسخين المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بمجرد تسخينه ، انقل 1.6 مل من المخزن المؤقت للتحرير لملء أنبوب تفاعل سعة 1.5 مليلتر بالكامل. بعد ذلك ، احتضان الجزء الوظيفي من السلك في المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، ضع السلك على شاكر بمعدل 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للسلك عند 300 جم لمدة 10 دقائق. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزاحة السلك من الأنبوب ، وأغلق الغطاء ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 300 جم لمدة 10 دقائق.

لتقليل حجم تعليق الخلية ، تخلص من كل المواد الطافية باستثناء 100 ميكرولتر للتلاعب الدقيق أو 300 ميكرولتر للطرد المركزي الخلوي اللاحق والتشريح الدقيق بالليزر. ثم انتقل بسرعة إلى أخذ العينات أحادية الخلية. للتلاعب الدقيق ، انقل 100 ميكرولتر بالكامل من تعليق الخلية إلى شريحة زجاجية.

بعد ذلك ، ضع الشريحة الزجاجية على مجهر مزود بمعالج دقيق واترك الخلايا تستقر لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، في أنابيب PCR سعة 0.2 ملليلتر ، قم بخلط ماصة ميكرولترين من تحلل الخلايا الرئيسي ونقلها على الجليد. استخدم المعالج الدقيق لجمع خلية واحدة في ميكرولتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X.

ثم انقل الخلية مباشرة إلى ميكرولترين من مزيج تحلل الخلية الرئيسي. استخدم جهاز الطرد الدقيق المكتبي لتدوير العينات بسرعة عند 2000 جم لمدة ثلاث ثوان لتجميع السائل في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، انقل العينة على الجليد وانتقل إلى تضخيم الجينوم الكامل القائم على رابط المحول.

استنشق خلية واحدة فقط باستخدام ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت كحد أقصى. عند نقل الخلية إلى محلول التحلل ، تأكد من رؤية فقاعات ناشئة عن المحلول ، مما يشير إلى أن كل حجم السحب قد تم نقله. بالنسبة للتشريح الدقيق بالليزر ، قم بالطرد المركزي الخلوي بالكامل 300 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة مغلفة بالغشاء عند 300 جم لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، ضع الشريحة المطلية بالغشاء على مجهر قادر على التشريح المجهري بالليزر. بعد ذلك ، تمزج الماصة 4.5 ميكرولتر من تحلل الخلايا الرئيسي في غطاء أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر. ضع الغطاء فوق العينة واحصد خلية واحدة عن طريق التشريح المجهري بالليزر.

بعد ذلك مباشرة ، تحقق من وجود خلايا معزولة في غطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وقم بإزالة أنبوب PCR من مجهر التشريح المجهري بالليزر وأغلق الأنبوب. اجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنبوب بدوران قصير. انقل العينة على الجليد ، وانتقل إلى تضخيم الجينوم الكامل القائم على رابط المحول.

تأكد من استعادة الخلية الدقيقة بالليزر. لذلك ، من المهم تغطية غطاء الأنبوب بالكامل بمحلول التحلل. بعد التشريح المجهري ، افحص غطاء الأنبوب بحثا عن وجود الخلية.

لإظهار الخلايا الملطخة ب CFSE و Hoechst 33342 ، تم إجراء التصوير المناعي الفلوري قبل شحن السلك ، أثناء توصيل الخلايا بالسلك ، ثم فصلها عن السلك ، وأخيرا على الشريحة. تظهر صور التألق المناعي للخلايا قبل الشحن بقعة نووية ساطعة باللون الأزرق ، بينما يظهر سيتوبلازم الخلايا صبغة CFSE خضراء مع كثافة غير متجانسة بين الخلايا. لوحظ أيضا نمط تلطيخ مماثل للخلايا المتصلة ومنفصلة لاحقا عن السلك.

للتحقق من جودة منتجات تضخيم الجينوم بالكامل ، تم تشغيل هلام الاغاروز بنسبة 1٪. يظهر جل الاغاروز مسحة الحمض النووي تتراوح من 0.2 إلى أكبر من 1 كيلو قاعدة لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجينوم الكامل. تنتج منتجات PCR لمراقبة الجودة 4plex التي تم الحصول عليها من الخلية المفردة منتجات من 100 و 200 و 300 و 400 زوج أساسي.

يتم استبعاد المنتجات التي تظهر أقل من ثلاثة نطاقات من مزيد من التحليل. بمجرد إتقانها ، تسمح هذه التقنية بعزل الخلايا المفردة عن معلقات الخلايا في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء الخلايا مغمورة في المخزن المؤقت ، خاصة أثناء الوقت الذي يتم فيه توصيل الخلايا بالسلك لتجنب إلحاق الضرر بالخلايا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق التحليل مثل التهجين الجيني المقارن للمنطقة ، وتسلسل الجيل التالي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالهدف من أجل توصيف الخلايا المفردة بناء على اختلافات عدد النسخ والطفرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا واستعادتها من معلقات الخلايا باستخدام سلك وظيفي وكيفية أخذ عينات من الخلايا المفردة للتحليل الجيني الجزيئي المتعدد في اتجاه مجرى النهر. لا تنس أن العمل بدم الإنسان يشكل احتمال الإصابة بالعدوى ، لذا فإن ارتداء القفازات ومعطف المختبر إلزامي أثناء إجراء هذا الإجراء.