صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة تهريب البروتين في الوقت الفعلي في الخلايا العصبية الأولية مثل GLUT4 في الخلايا العصبية تحت المهاد مع الحد الأدنى من الضرر. يمكن أن تشرح هذه الطريقة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتنظيم العصبي لإشارات الأنسولين والتمثيل الغذائي كما هو الحال في حالة داء السكري من النوع 2. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للباحثين عزل مزارع الخلايا الأولية ومراقبة التأثير الناجم عن الدواء في الوقت الفعلي.

المعنى الضمني لهذه التقنية في اختيار علاج لمرض السكري من النوع 2 أو مقاومة الأنسولين المرتبطة بالدماغ لأننا نعرف الآن كيف يتم تغيير إشارة الأنسولين هذه بواسطة الكيموكين CCL5 في الخلايا العصبية تحت المهاد. لبدء هذا الإجراء ، قم بتغطية أطباق الثقافة باستخدام lysine poly-D قبل يوم واحد من الثقافة. للحصول على طبق مكون من ستة آبار ، أضف 1.5 مل من poly-D lysine بمعدل 0.05 مجم / مل لكل بئر.

في اليوم التالي ، قم بإزالة poly-D lysine واغسل الأطباق مرتين باستخدام 2 مل من ddH2O. ثم املأ أطباق بتري مقاس 10 سم ب 20 مل من وسط الغسيل واحتفظ بها على الثلج. املأ الأنابيب سعة 15 مل بوسط الغسيل واحتفظ بها على الثلج.

لعزل أنسجة المخ ، قم بتعقيم المنصة وتشريح المجهر وأدوات الجراحة باستخدام 75٪ من الإيثانول لتجنب التلوث. بعد ذلك ، قم بقطع منطقة الحبل السري لعزل الجراء دون إتلافها. بعد ذلك ، قم بإزالة رأس كل جرو وثبته في مكانه باستخدام ملقط مستقيم ذو رؤوس دقيقة.

استخدم ملقطا منحنيا آخر ذو رؤوس دقيقة لإزالة الجلد الخارجي والجمجمة من كلا الجانبين وتقشيرهما من الأمام إلى الاتجاه الظهري. بعد ذلك ، احتفظ بالأدمغة المعزولة في طبق بتري نظيف مع وسط غسيل مثلج بارد. اقلب الدماغ وحافظ على الجانب البطني لأعلى.

بعد ذلك ، قم بعزل أنسجة ما تحت المهاد باستخدام ملقط منحني رفيع الرؤوس. امسك الفص الشمي بالملقط الحاد وانزع السحايا الرقيقة المحيطة بالدماغ كله بالملقط المنحني. اقلب إلى الجانب السفلي من القشرة وافصل الحصين عن القشرة عن طريق سحبه إلى الجانب.

عندما يتم عزل جميع مناطق الدماغ ، قم بتقطيع هذه الأنسجة في أنابيب سعة 15 مل تحتوي على وسط غسيل مثلج بارد. في هذا الإجراء، اشطف المناديل عن طريق قلب الأنبوب المحتوي على الأنسجة مرتين إلى ثلاث مرات. بعد ذلك ، حافظ على الأنبوب مستقيما للسماح للأنسجة بالاستقرار.

قم بإزالة الوسط العلوي باستخدام ماصة باستور الزجاجية المتصلة بنظام تفريغ. لغسل الأنسجة ، أضف 15 مل من وسط الغسيل المثلج البارد واقلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة وسط الغسيل بمساعدة ماصة سعة 1 مل.

احتضان الأنسجة باستخدام عازلة هضم غراء تريبسين في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة سبع إلى 14 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحييد نشاط الإنزيمات عن طريق إضافة حجم واحد من مصل الأبقار الجنينية. احتفظ بالأنبوب على الرف وانتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين للسماح للأنسجة بالاستقرار.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل. أضف 6 مل من وسط الطلاء إلى أنبوب الاختبار وقم بتحريك الأنسجة لأعلى ولأسفل 50 مرة برفق باستخدام ماصة سعة 5 مل. احتفظ بالأنبوب على الرف وانتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين للسماح للأنسجة المكتنزة غير المنفصلة بالاستقرار.

بعد ذلك ، انقل المرحلة العليا التي تحتوي على خلايا منفصلة إلى أنبوب جديد وقم بتخفيفها بوسط الطلاء. ثم أضف 2 مل من وسط الثقافة الكامل في كل بئر من الطبق المكون من ستة آبار. لتحضير الخلايا للتصوير الحي ، قم بإزالة زلات الغطاء بعناية باستخدام الخلايا العصبية باستخدام الملقط وضعها على الشريحة الزجاجية بحذر.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط الزائد باستخدام مناديل مهمة دقيقة عن طريق طيها مرتين ووضعها بعناية على زلة الغطاء دون تحريكها. من الضروري إزالة الكمية الزائدة من الوسط لمنع الحركة غير الضرورية على زلة الغطاء. بعد ذلك ، عالج عينات الخلايا المختارة ب CCL5 عند 10 نانوغرام / مل أو الأنسولين بمعدل 10 وحدات / مل لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، أضف 1.5 مل لتر من الأنسولين المخفف على حافة زلات الغطاء. بعد ذلك ، أضف زيت الغمر على عدسة موضوعية مكبرة 60 مرة 1.52 NA. بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء على مرحلة مجهر إزالة الالتفاف مع انزلاق الغطاء متجها لأسفل وتثبيته بشكل صحيح.

استخدم المجال الساطع أو إضاءة التألق لتحديد الخلايا المستهدفة. بعد ذلك ، اضبط التركيز حتى يمكن ملاحظة الخلايا المستهدفة بوضوح. لا تحرك العدسة الموضوعية خارج منطقة انزلاق الغطاء لتجنب علامات الخدش غير الضرورية.

بعد ذلك ، حدد GFP-GLUT4 بواسطة إشارة GFP. ثم حدد الخلايا المستهدفة المطلوبة للحصول على الصور. بعد ذلك ، قم بتعيين المعلمات التجريبية المناسبة على كل خلية مستهدفة ، بما في ذلك رقم البكسل ، والطول الموجي للإثارة ، ونسبة الإرسال ، ووقت التعرض ، وسمك المكدس ، والفاصل الزمني ، وإجمالي وقت التصوير.

اضبط معلمة التعريض الضوئي على ما يقرب من 2000 إلى 3000 عدد لتحقيق أقصى كثافة للبكسل. لتقليل تبييض الصور الفلورية ، قلل من النسبة المئوية لانتقال ضوء الإثارة قدر الإمكان مع الحفاظ على وقت التعرض أقل من ثانية واحدة. قم بتعيين الحد العلوي والسفلي لمكدس Z على كل خلية مستهدفة عن طريق تحريك مرحلة المجهر حتى يصبح كل من الجزء العلوي والسفلي من الخلية المستهدفة خارج نطاق التركيز البؤري قليلا.

من المهم جدا تقليل تبييض الصور الفلورية في موت الخلايا العصبية بعد الصورة الخفيفة. يوضح هذا الشكل أن الخلايا العصبية تحت المهاد الأولية المزروعة تم تصنيفها بعلامة الخلايا العصبية MAP2. علامة الخلايا العصبية تحت المهاد POMC وتعبيرها المشترك عن CCR5.

تظهر الصورة الموضعية المشتركة أن CCL5 يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية تحت المهاد الإيجابية ل POMC. تظهر هذه الصور التعبير عن بروتين GFP-GLUT4 في الخلايا العصبية تحت المهاد من النوع البري والخلايا العصبية تحت المهاد السلبية المزدوجة CCR5. تم تحفيز الخلايا العصبية بالأنسولين أو CCL5.

تشير الأسهم إلى ثقب GFP-GLUT4 في التهاب العصب قبل أو بعد تحفيز الأنسولين أو CCL5 ، وتشير العلامات النجمية إلى سطح GLUT4-GFP قبل أو بعد تحفيز CCL5. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذا التسجيل المختبري لتقنية الخلية الأولية بين ساعة إلى أربع ساعات ، ويعتمد على متطلبات التجربة وما إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف إمكانية توصيف التأثير الفوري الناجم عن الأدوية في زراعة الخلايا الأولية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العصبية تحت المهاد الأولية ، والخلايا العصبية الحصين ، والخلايا العصبية القشرية. بجانب المختبر ، يمكنك أيضا معرفة كيفية إجراء تسجيل مباشر للجزيء التسلسلي بناء على محفزات مختلفة. لا تنس ارتداء معطف المختبر والقفازات واستخدام الإيثانول بشكل متكرر لتجنب التلوث من البكتيريا والفطريات من.

كن حذرا جدا أيضا أثناء التعامل مع زلات الغطاء والخلايا العصبية طوال هذا الإجراء.