تحليل دورة الخلية

تشير دورة الخلية إلى مجموعة العمليات الخلوية والكيميائية الحيوية التي تحدث داخل الخلية مما يؤدي إلى انقسامها. تمر الخلية بمراحل مختلفة من الدورة ، والوقت المستغرق لإكمال هذه العملية يكاد يكون ثابتا لنوع الخلية. أي انحراف عن هذه المدة يدل على انقسام الخلايا غير الطبيعي. لذلك ، يصبح تحليل دورة الخلية أداة مفيدة للغاية لعلماء الأحياء المهتمين بدراسة آليات انقسام الخلايا ، والتي ستساعد في النهاية في علاج المرضى الذين يعانون من أمراض مثل السرطان ، حيث تتعطل دورة الخلية.

سيناقش هذا الفيديو المبدأ والبروتوكول المعمم لتحليل دورة الخلية. أخيرا ، سنعرض بعض تطبيقات هذه الطريقة شائعة الاستخدام.

دعنا نتعلم ما هو تحليل دورة الخلية ، وكيف يعمل هذا الفحص.

بشكل أساسي ، يخبرنا تحليل دورة الخلية لمجموعة مختلطة بعدد الخلايا الموجودة في كل مرحلة من المراحل المختلفة. يتم ذلك بشكل شائع عن طريق تقييم محتوى الحمض النووي للخلية. قد تفكر: لماذا محتوى الحمض النووي؟ لفهم ذلك ، دعنا نراجع بإيجاز ما يحدث للحمض النووي للكروموسومات مع تقدم الخلية خلال الدورة.

خلال مرحلة G1 ، لا يتغير محتوى الحمض النووي داخل الخلية. خلال المرحلة S ، يحدث تكرار الحمض النووي ، وبحلول نهاية هذه المرحلة يتضاعف محتوى الحمض النووي. في مرحلة G2 ، تتحقق الخلايا من عدم وجود أخطاء في تكرار الحمض النووي ، وأخيرا - في نهاية المرحلة M - ينقسم هذا الحمض النووي بالتساوي إلى خليتين ابنتيتين. لذلك ، يمكن أن يساعد وضع العلامات على الحمض النووي العالم في تحديد مرحلة دورة الخلية.

أحد الاعتبارات المهمة لهذه الملصقات هو اختيار صبغة ربط الحمض النووي. برومودوكسي يوريدين ، أو BrdU ، هو نظير من الحمض النووي ويحاكي الثيميدين هيكليا. هذا يسمح ل BrdU بالاندماج في الخيط المتنامي أثناء تكرار الحمض النووي. لذلك ، فإن هذه الصبغة تصنف الخلايا في المرحلة S فقط. بعد دمج BrdU ، يتم فصل خيوط الحمض النووي ، ويتم اكتشاف BrdU بمساعدة الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت.

المركبات الأخرى ، مثل يوديد البروبيديوم أو PI ، وهو فلوري بطبيعته ، تتقاطع بين الأحماض النووية المزدوجة التي تقطعت بهم السبل ، وبالتالي تلطخ الخلايا في جميع المراحل. ومع ذلك ، فإن كمية تلطيخ PI تتناسب مع كمية الحمض النووي.

على الرغم من أن اختيار البقعة يعتمد على التجربة قيد الإجراء ، إلا أن الباحثين غالبا ما يستخدمون إجراءات تلطيخ مزدوجة. يمكن للجزيئات مثل PI التي ترتبط بشكل متناسب بجميع الخلايا أن تفرق بسهولة بين خلايا G1 وخلايا الطور G2 أو M. ومع ذلك ، لا تزال خلايا المرحلة S في مرحلة انتقالية. لذلك ، فإن إضافة جزيئات مثل BrdU التي تسمي خلايا الطور S فقط تزيد من خصوصية اكتشاف مرحلة دورة الخلية. أخيرا ، يتم تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي لتعداد الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

الآن بعد أن فهمت المبادئ الكامنة وراء تلطيخ دورة الخلية ، دعنا نناقش إجراء باستخدام BrdU و PI.

قم بإعداد أطباق زراعة الخلايا: واحدة للتجربة ، وثلاثة أخرى كعناصر تحكم. عند حوالي 60٪ من التقاء ، يضاف BrdU المذاب في وسط الاستزراع إلى الخلايا الحية ، يليه الحضانة. في هذه المرحلة ، يتم دمج BrdU في الحمض النووي المتماثل.

بعد الحضانة ، يتم طرد الخلايا وإعادة تعليقها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS. بعد ذلك ، يتم إصلاح الخلايا عن طريق إضافة تعليق الخلية بالتنقيط إلى الإيثانول المثلج بنسبة 70٪ أثناء الدوامة برفق. هذا يوقف انقسام الخلايا ويمنع التكتل.

يتم طرد الخلايا الثابتة مرة أخرى وإعادة تعليقها في PBS. بعد ذلك ، يضاف محلول حمضي مركز يحتوي على منظف ، مثل Triton-X ، إلى الخلايا بالتنقيط. يتخلل المنظف الخلايا للسماح بدخول مركبات غير منفذة للغشاء ، ويقلل الحمض من درجة الحموضة ويفسد طبيعة الحمض النووي ، مما يعرض BrdU. ثم يتم طرد الخلايا ، ويتم التخلص من المادة الطافية ، ويتم تعليق الحبيبات في محلول قلوي لاستعادة درجة الحموضة.

أخيرا ، يتم غسل الخلايا باستخدام PBS وتحضنها بجسم مضاد BrdU مترافق مع علامة فلورية في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الخطوة ، يجب حماية العينات من الضوء لتجنب التبييض الضوئي.

عند التلوين المزدوج ، يتم تحضين الخلايا باستخدام PI و RNase. RNase ضروري لإزالة الخيوط المزدوجة RNA-RNA أو RNA-DNA ، والتي ترتبط أيضا ب PI ويمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. ثم يتم تمرير الخلايا عبر مصفاة خلية لعمل تعليق خلية واحدة ، وهو أمر ضروري لتحليل التدفق الخلوي.

الآن بعد أن تعلمت بروتوكول التلوين ، دعنا نراجع كيفية تحليل البيانات التي تم الحصول عليها.

باختصار ، في قياس التدفق الخلوي ، يضيء شعاع الليزر على تيار ضيق من تعليق الخلية المفردة ، ويتم الكشف عن الانبعاث بأطوال موجية معينة من الأصباغ في كل خلية كحدث واحد على مخطط مبعثر.

هنا ، تظهر مخططات مبعثرة الخلايا الملطخة ب PI مجموعتين متميزتين ، إحداهما بها ما يقرب من ضعف كمية PI من الأخرى. بعد تحسين كاشف PI ، تظهر هذه المجموعات كقمتين في تحليل الرسم البياني. تمثل الذروة عند شدة PI الأكبر خلايا G2 / M ، وتلك ذات الكثافة المنخفضة تمثل خلايا G1. تمثل المناطق الواقعة تحت هذه القمم عدد الخلايا في المراحل المقابلة.

وبالمثل ، يمكن عرض أحداث BrdU-FITC في تحليل الرسم البياني على مقياس لوغاريتمي. توضح هذه المؤامرة أن الخلايا الإيجابية BrdU أكثر إشراقا بشكل واضح من الخلايا غير الملطخة ، وبما أن جزءا صغيرا فقط من السكان في المرحلة S ، يمكن رؤية ذروة أكبر من خلايا BrdU غير الملوثة.

يمكن عرض مخطط مبعثر الخلايا الملطخة ب BrdU و PI باستخدام PI على المحور X الخطي و BrdU على المحور Y اللوغاريتمي ، وهذا يظهر نمط حدوة حصان ينتقل من G1 ، S ، إلى G2. يمكن تحديد نسبة الخلايا في المناطق المسورة وعرضها على رسم بياني شريطي.

الآن بعد أن مررنا بالبروتوكول الأساسي لتحليل دورة الخلية ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدامه في إعدادات تجريبية مختلفة.

أ. من خلال الجمع بين التلاعب الجيني وتحليل دورة الخلية ، يدرس العلماء أدوار بروتينات معينة في تقدم دورة الخلية. في هذه الدراسة ، بالغ العلماء في التعبير عن بروتين يسمى p27 في الخلايا الليفية الجنينية للفئران. توضح النتائج أن الإفراط في التعبير أدى إلى انخفاض أعداد الخلايا في المرحلة S ، مما يشير إلى أن هذا البروتين يلعب دورا مهما في تنظيم دورة الخلية.

باستخدام تحليل دورة الخلية ، يمكن للعلماء مقارنة حركية التقدم. هنا ، تمت مقارنة حركية التقدم بين خطين من خلايا سرطان القولون والمستقيم وخط خلايا سرطان الثدي. أظهرت النتائج أن خلايا سرطان الثدي تقدمت خلال دورة الخلية بمعدل أبطأ مقارنة بخطوط خلايا القولون والمستقيم ، بالنظر إلى النسبة المئوية الأعلى لخلايا سرطان الثدي في G1 بمرور الوقت.

أخيرا ، بالنسبة لتحليل دورة الخلية في الجسم الحي ، يمكن حقن BrdU في القوارض ويمكن عزل مجموعة الخلايا المستهدفة لتحليل دورة الخلية. في هذه الدراسة ، تم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا الجذعية الجذعية للفئران المحقونة BrdU لتحليل قياس التدفق الخلوي. كشفت البيانات التي تم جمعها عن توزيع الخلايا الجذعية السرطانية بين مراحل دورة الخلية المختلفة مع الغلبة في مرحلتي G1 و S.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحليل دورة الخلية. لقد راجعنا المبادئ الكامنة وراء هذه العملية ، وقمنا بتفصيل بروتوكول خطوة بخطوة ، وراجعنا كيفية استخدام هذا النوع من التحليل في إعدادات تجريبية مختلفة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!